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1、HIF-1、COX-2在实验性高原重症急性胰腺炎中的表达【摘要】目的讨论hif-1和x-2在高原重症急性胰腺炎(sap)中的作用以及二者之间的关系，初步讨论高原sap的发病机制，为更好的诊治sap提供理论基矗方法将72只spf级安康雄性istar大鼠随机根据海拔不同分为3个大组(每组24只)，再将每个大组随机分成4个小组(每组6只)。采用向胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠的方法建立sap动物模型。sap组(p组)在造模后的第6、12、24h分批处死大鼠，假手术组(n组)在造模后6h处死大鼠，分别测定血清淀粉酶(ay)、胰腺组织缺氧诱导因子(hif-1)和环加氧酶-2(x-2)含量，观察胰腺组织病理
2、变化并评分。结果p组各时点的胰腺病理评分及ay、x-2、hif-1均较n组显著增高(p0.05)。三个海拔的p组相比，胰腺病理评分及hif-1、x-2的表达具有显著性差异(p0.05)。hif-1、x-2、he评分呈正相关(p0.05)。结论hif-1、x-2在sap的早期即被激活，被激活因子可能在sap的始发阶段起重要作用;hif-1与x-2亲密关联;hif-1、x-2在高原sap的发生开展中起重要作用。【关键词】重症急性胰腺炎高原缺氧诱导因子-1环氧合酶-2severeautepanreatitisatplateauanyaning1,uxinin1,guyain1,zhangxiafen
3、g2(1.qinghaiprvinepepleshspital;2.linfenityfshanxiprvinepepleshspital)abstratbjetivetinvestigatetheeffetfhypxia-induiblefatr-1(hif-1)andylxygenase-2(x-2)insevereautepanreatitis(sap)atplateauareaanddisusstherelatinshipbeteenhif-1andx-2inrderthatlarifyingtheehanisfsapandprvidingthebasisfrtreatentfthis
4、disease.ethds72speifipathgenfree(spf)istaraleratseredividedintthreegrupsrandly(n=24ineahgrup).everygrupassubdividedintfursubgrups(n=6ineahgrup).panreatitisdelasinduedbyintra-dutadinistratinf5%nat.theexperientalgrupastreatedat6h,12hand24hafternatinjetinandtheshagrupat6thafterperatin.thententsfaylasei
5、nseru,histlgialsresfpanreatitissuesandthententsfhif-1andx-2inpanreatiereeasuredrespetively.resultsparedtshagrup,seruaylaselevel，hif-1andx-2inpanreatitissuesandhistlgialsresfpanreatitissueseresignifiantlyinreased(p0.05)insapgrup.thereasasignifiantdifferene(p0.05)inhistlgialsres,ntentfhif-1andx-2angth
6、reealtitudessapgrup.thereasshnapsitiverelatinship(p0.05)anghistlgialsres,hif-1andx-2.nlusintheexpressinfhif-1andx-2ayplayaniprtantrleinearlystagefsapandthetfatrsshapsitiverelatinship.hif-1andx-2aylselyrelateithpathgenesisandprgnsisfplateausap,t.keyrdssevereautepanreatitisplateauhypxia-induiblefatr-1
7、ylxygenase-2重症急性胰腺炎(severeautepanreatitis，sap)起病急、进展快、病情危重、并发症多、死亡率高。众多学者致力于其发病机制的研究，并不断获得新的进展，但至于详细发病机制仍不明晰。在高原地区的sap由于低氧血症和血液粘稠度增高，致使病情更加严重，治疗更棘手1。因此高原胰腺炎有其自身的特点。对于高原sap发病机制的研究在国外很少，国内尚属空白。近来的研究认为sap早期即有缺血缺氧情况，并因此发生一系列的病理生理变化，致sap加重，然而这一详细过程如何发生尚未清楚。缺氧诱导因子-1(hypxia-induiblefatr-1,hif-1)作为在缺氧的适应性反响
8、中的核心因子2，最初的研究重点在机体耐受缺氧、维持肿瘤细胞的能量代谢、新血管生成3等方面。随着研究的深化，发现hif-1调节的靶基因数目逐渐增多，对hif-1所发挥的作用认识也逐渐全面。graer等4人证实了hif-1在炎症中的重要作用。因此，hif-1可能在sap，尤其在高原sap中发挥重要作用。环加氧酶-2(ylxygenase-2,x-2)与炎症关系亲密，ethridge等5利用x-2基因敲除的小鼠来制造sap的动物模型，结果发现胰腺几乎没有炎症改变。本实验通过在不同海拔建立sap动物模型，观察在不同海拔动物sap中的hif-1、x-2表达程度、血液生化指标和胰腺组织病理变化，旨在讨论h
9、if-1、x-2在高原sap中的作用机制。1材料与方法1.1实验材料及试剂安康雄性spf级istar大鼠72只，体重(20020)g，购于甘肃中医学院实验动物中心(动物合格证号：sxk2022-0006)。牛磺胆酸钠(nat)购于意大利inalspa公司，兔抗大鼠hif-1多克隆抗体、x-2酶标偶合液、sab试剂盒、dab显色剂均购于北京博奥森生物公司。1.2动物分组72只大鼠随机分成3个大组：海拔1500组(l组)、海拔3300组(组)、海拔4300组(h组)。每个大组随机分成4个小组：假手术组(n组)、胰腺炎6h组(p6h)、胰腺炎12h组(p12h)、胰腺炎24h组(p24h)。l组从兰
10、州(海拔1500)购置回后立即进展造模，其余大鼠送入河卡(海拔3300)、温泉(海拔4300)地区习服20天后在当地造模。1.3动物模型的制作各组实验大鼠术前禁食12h，自由饮水。用1%苯巴比妥钠(4l/kg)行腹腔注射麻醉。n组大鼠翻开腹腔后，仅对胰腺翻动数次后关腹。p组探查到肝总管后，用无创血管夹夹闭。术者右手用4.5号钝头注射器从十二指肠肠系膜对侧选一无血管区进针，刺穿外侧肠壁，自乳头插入胰胆管，左手轻轻捏住进针处胰胆管，防止针头滑脱。缓慢注入5%nat(1l/kg)。30s后可见胰腺充血，拔出针头，松开血管夹，压迫肠管穿刺点5in后关闭腹腔。n组于造模后6h全部处死，p组在造模后第6、
11、12、24h三个时点分批处死。分别自腹主动脉采血;切取胰腺组织。1.4测定工程及方法用全自动生化分析仪测定各组大鼠血清淀粉酶(aylase,ay)含量，大鼠胰腺组织常规以苏木素-伊红(heatxylin-esin,he)染色并行光镜观察，然后根据greal6评分标准进展评分(见表1)。应用免疫组化sp法分析各组大鼠胰腺hif-1染色程度，以细胞浆或细胞核有棕黄色颗粒为阳性细胞，否那么为阴性，根据牛彦锋7等评分标准进展评分。取局部胰腺组织匀浆后，用elesa法测定各组大鼠胰腺组织x-2含量。首先测定出标准浓度值，绘出标准曲线，根据标准曲线计算样本的浓度。x-2含量标准曲线见图1。图1x-2的标准
12、曲线表1sap胰腺病变严重程度评分标准(改进greal法)组织病变评分标准01234水肿无轻度叶间隙增宽重度叶间隙增宽腺泡间隙增宽细胞间隙增宽坏死面积比无1%10%11%20%21%30%30%炎症每5个炎症细胞计0.5分，超过30个计4分出血无有出血-注：得分=水肿评分+坏死评分+炎症评分+出血评分.1.5统计学处理方法所有数据均用spss11.5统计软件完成，实验数据均以均数标准差(xs)表示。组内及组间比拟用ne-ayanva，并用snk进展两两比拟;病理评分及x-2、hif-1的相关关系采用pearsn相关分析。检验水准取=0.05。2结果2.1胰腺组织病理改变及评分结果n组大鼠根本正
13、常;p6h组胰腺水肿、血管周围有炎性细胞浸润;p12h组腺泡细胞变性、大片出血、腺泡间有炎性细胞浸润;p24h胰腺广泛出血、坏死，胰腺及网膜组织有多处皂化斑。评分统计见表2。表2三组大鼠胰腺he病理评分2.2ay检测结果(见表3)表3三组大鼠ay活性(u/l，xs)注：*表示与n组比拟p0.05;#表示与p6h组比拟p0.05.2.3胰腺hif-1含量检测结果免疫组化染色图显示：n组几乎没有棕黄色颗粒;p6h组和p12h组可见局部细胞胞浆有棕黄色颗粒;p24h组几乎满视野的细胞胞浆内均有棕黄色颗粒，局部细胞核上有棕黄色颗粒。评分统计见表4，免疫组化情况见图28。表4三组大鼠胰腺hif-1免疫组
14、化评分注：*表示与n组比拟p0.05;#表示同一海拔内p组各时点两两比拟p0.05;表示三个海拔间p组同一时点两两比拟p0.05.2.4胰腺x-2含量检测结果(见表5)表5三组大鼠胰腺x-2含量注：*表示与n组比拟p0.05;#表示同一海拔内p组各时点两两比拟p0.05;表示三个海拔间p组同一时点两两比拟p0.05.2.5hif-1、x-2及病理评分的相关关系在hp组：hif-1与病理评分呈正相关关系(r=0.733，p0.05);x-2与病理评分呈正相关关系(r=0.780，p0.05);hif-1与x-2呈正相关关系(r=0.942，p0.05)。在p组、lp组大鼠胰腺组织hif-1、x-
15、2及病理评分三者彼此间都呈正相关关系。3讨论目前公认的sap的始动因素是胰酶的异常激活与释放、胰腺的自身消化8,9，而后引起炎症介质瀑布样级联反响，大量炎症介质进入血流，引发全身炎症反响综合症(systeiinflaatryrespnsesyndr，sirs)，最终导致其他脏器及全身组织受损。由于在始动因素之后，参与的因子众多，机制复杂，至今sap的发病机制尚未完全说明，但细胞因子(ytkine,k)在sap中的重要作用是不容质疑的10。3.1hif-1、x-2与saphif-1是迄今为止发现的惟一一种在缺氧情况下发挥特定作用的转录因子，由120kd的hif-1亚基和9194kd的hif-亚基
16、两个亚单位组成，其中hif-1那么为hif-1所特有11。hif-1蛋白链-末端由约200个氨基酸序列构成，被称为氧依赖性降解区(xygen-dependentdegratindain,dd)。dd区内的两个脯氨酸残基pr402和pr564羟基化调节对于vhl表达的pvhl介导的hif-1降解起关键作用，这就需要氧依赖的脯氨酸羟化酶的参与12。脯氨酸残基羟化后，pvhl才能与hif-1的dd发生互相作用，其功能是作为泛肽配体使得hif-1泛素化，从而被降解。这个过程依赖hif-1降解的增加，而不是其转录的减少11。因此，hif-1在常氧及正常生理情况下在人体内的表达量极少。低氧可以减少hif-1
