芦丁标曲的制作

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1、【关键字】结构黄酮类化合物的结构黄酮类化合物以黄酮（2-苯基色原酮）为母核而衍生的一类黄色色素。其中包括黄酮的 同分异构体及其氢化的还原产物 ，也即以 C6-C3-C6 为基本碳架的一系列化合物。 二氢黄酮类 二氢黄酮醇类黄烷3，4二醇类（Flavanones）（Flavanonols）（Flavan-3,4-diols）黄烷三醇类（Flavan-3-ols）芦丁1.3 黄酮类物质的提取1.3.1 溶剂提取法 水提法热水仅限于提取甙类,例如自槐花米中提取芦丁。由于热水浸提时易溶于水的杂质（如 蛋白质、鞣质、淀粉、多糖类化合物等）较多,后处理较复杂,提取效率也不高,故不常使用。 有机溶剂提取法黄

2、酮类化合物的提取,主要是根据被提取物的性质及伴随的杂质来选择适合 的提取溶剂,甙类和极性较大的甙元,一般可用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水或某些极性 较大的混合溶剂进行提取。大多的甙元宜用极性较小的溶剂,如乙醚、氯仿、乙酸乙酯等来 提取,多甲氧基黄酮类甙元,甚至可用苯来提取。乙醇和甲醇是最常用的黄酮类化合物提取溶 剂，高浓度的醇（如90%95% ）宜于提取甙元,60%左右浓度的乙醇或甲醇水溶液适宜于提取 甙类物质。如采用70%乙醇提取芦笋中芦丁，浸提5h,条件为最优。提取过程中常用冷浸法或 回流法,提取次数一般为 2-4 次。两种方法各有优缺点前者无需加热,有好处保持提取物的成 分,但提取时间

3、长,效率低，后者效率高,但需加热,因此成分不稳定的原料（如一些中药药材）不 宜用此法。一般来说,醇提法的对总黄酮的提取效果要好于水提法。碱溶酸沉法由于黄酮类成分大多具有酚轻基,具有易溶于碱性水而难溶于酸性水的性质,可用 碱性水（如碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钙水溶液）或碱性稀醇（如 50%乙醇）浸出,在提取液中, 加酸酸化,黄酮类化合物即可沉淀析出。用碱性溶剂提取时，所用的碱浓度不宜过高,以免在 强碱下加热时破坏黄酮类化合物母核,当有邻二酚轻基时,应加硼酸保护。常用饱和石灰水溶 液、稀氢氧化钠溶液或 5%碳酸钠水溶液提取。氢氧化钠水溶液的浸出能力高,但杂质较多不 好处纯化；石灰水可以使一些鞣质或水

4、溶性杂质沉淀成钙盐沉淀,有好处浸液纯化,但是浸出 效果不如氢氧化钠水溶液效果好 ,同时有些黄酮类化合物能与钙结合成不溶性物质 ,不被溶 出。例如从菊花中提取黄酮类物质时，用pH=10的氢氧化钠溶液浸出效果较好；从槐米中提 取芦丁,则应用碱性较强的饱和石灰水作溶剂,这样则有好处芦丁成盐溶解；选用硼砂缓冲饱 和石灰水的碱性可保护芦丁的黄酮母核不受破坏,用亚硫酸氢钠为抗氧剂可保护芦丁的邻二 酚羟基。碱溶酸沉法在实际生产中应用较广泛,具有经济安全方便等优点。1.3.2 微波提取法微波是一种非电离的电磁辐射, 被辐射物质的极性分子在微波电磁场中快速转向及定向排 列,从而产生撕裂和相互摩擦引起发热,同时可

5、以保证能量的快速传递和充分利用。微波提取 技术的研究表明,微波技术应用与天然产物的提取具有选择性高、操作时间短、溶剂耗量少 有效成分得率高的特点。浸出过程中材料细粉不凝聚、不糊化,克服了热水提取法易凝聚、 易糊化的缺点。1.3.3 超声波提取法 超声波提取黄酮类物质,是目前比较新的方法。超声提取原理是利用超声波在液体中产生“空 穴作用”,破坏植物细胞和细胞膜结构,从而增加细胞内容物通过细胞膜的穿透能力,有助于黄 酮类化合物的释放与溶出；超声波使提取液不断震荡,有助于溶质扩散,同时超声波的热效应 使水温基本在57r,对原料有水浴作用，缩短了提取时间,提高了有效成分的提出率和原料的 利用率。超声波

6、提取操作简便快捷、无需加热、提出率高、速度快、提取物的结构未被破坏、 效果好,显示出明显的优势。1.3.4 酶解法 对于一些黄酮类化合物被细胞壁包围不易提取的原料,传统的热水、碱、有机溶剂提取法,受 细胞壁主要成分纤维素的阻碍,往往提取效率较低。恰当地利用酶处理这些植物材料, 可改变 细胞壁的通透性,提高有效成分的提取率。根据传质理论,溶剂向固体表面扩散,渗透固体表面, 进入固体内部及固体内部微孔隙内 ,溶解黄酮类化合物,通过固体微孔隙向固体表面扩散,在 表面与溶剂主体间,由于浓度差作用力,黄酮类化合物向溶剂主体扩散,完成提取传质过程。采 用酶解法却能使细胞壁疏松、破裂,减小传质阻力,从而提高

7、提取效率。1.3.5 超临界流体萃取法 超临界流体萃取（ SFE） 它具有传质速度快、溶解能力强、低温操作、节能等优点, 引起国内 外有关专家及学者的普遍关注 ,特别是用该技术提取天然产物有效成分成为人们研究的热 点。超临界流体有近液体的溶解力,有气体那样向固体和高粘度物质较强的渗透性。且超临 界流体的密度当温度或压力有微小变化时 ,它能有较大的变化,这样超临界流体提取,就是依 据它的这个特性，利用密度的变化对物质溶解力的差异，实现分离混合物的。一般多采用CO2 为超临界溶剂,CO2具有性质稳定、无毒、且不燃不爆、临界压力不高、操作温度低、价廉 易得等特点。超临界CO2是非极性溶剂，对非极性和

8、分子量很低的极性物质表现出很好的溶 解性，但对极性较强的物质溶解能力不足，虽然增大密度能使其溶解能力提高，但增大密度需 提高萃取压力，这将使萃取设备的费用显著增加， 不适于大规模生产。1.3.6 双水相萃取分离法 双水相体系是由两种水溶性高分子化合物或一种高分子化合物与一种盐类在水中所形成的 互不相溶的两相体系，由于被分离物在两相中分配不同， 便可实现分离。与传统的油- 水溶剂 萃取体系相比，排除了使用有毒、易燃的有机溶剂，能够提供温和的水环境， 避免了被萃成分 的脱水变性，目前一般用于生物物质如蛋白质类的分离研究，在植物黄酮提取方面的研究还比 较少。如采用双水相萃取法对银杏叶浸出液中黄酮类化

9、合物进行萃取，具有萃取温度低，时间 短，且分相速度快，萃取效率可达 98% ，高于溶剂萃取的萃取率。估计在未来，双水相萃取分离 法将为黄酮类化合物的提取分离提供一种新型有效方法。1.3.7 半仿生提取法 半仿生提取法是近几年提出的新方法。它是从生物药剂学的角度，将整体药物研究法与分子 药物研究法相结合，模拟口服药物经胃肠道转运吸收的环境，采用活性指导下的导向分离方法， 具有有效成分损失少、成本低、生产周期短的特点。在操作中，根据仿生学原理，人体胃、小 肠、大肠的体液酸度最佳pH分别为2.10,7.15,8.13,先将原料用一定pH的酸水提取,继以一 定 pH 的碱水提取，提取液分别过滤、浓缩。

10、2 实验材料与方法2.1 实验试剂名称 盘龙参 无水乙醇 芦丁标准品 石油醚 乙酸乙酯 亚硝酸钠 硝酸铝 氢氧化钠 氯仿 甲醇纯度厂商（2500 mL,分析纯）（1 g,生化试剂）（500 mL,分析纯）（500 mL,分析纯）（500 g,分析纯）（500 g,分析纯）（500 g,分析纯）（500 mL,分析纯）（500 mL,分析纯）（安徽安特生物化学有限公司）（国药集团化学试剂有限公司） （ 天津市光复科技发展有限公司） （天津市富宇精细化工有限公司）（天津市大茂化学试剂厂）（天津市光复精细化工研究所） （天津市科密欧化学试剂公司） （湖南汇虹试剂有限公司）（汕头市面陇化工厂有限公司）

11、薄层层析硅胶 羧甲基纤维素钠2.2 试验设备 名称 RE-52 旋转蒸发仪 SHZ-D 真空泵 AL-104 电子分析天平（500 g,化学纯）（500 g,分析纯）GZX-9100ME 恒温干燥箱WFZ.UV-2100型可见分光光度计超纯水仪KQ-C 玻璃仪器气流烘干机2.3 试剂的配制（青岛海浪硅胶干燥剂厂）（天津市科密欧化学试剂开发中心）厂商巩义市英峪予华仪器厂 巩义市英峪予华仪器厂 梅特勒托利多仪器（上海）有限公司 上海博远实业有限公司医疗设备厂 尤尼柯（上海）仪器有限公司 广大力德高端水处理设备巩义市英峪予华仪器厂芦丁标准品的配制：10 mg 芦丁标准品（芸香叶苷,三水）加入几滴乙醇

12、溶解,加入60%乙 醇定容至100 mL,摇匀，即得标准品。5%亚硝酸溶液：精密称取10.00 g亚硝酸钠，溶解，定容至200 mL,即得。10%硝酸铝溶液：精密称取35.21 g九水硝酸铝，溶解，定容至200 mL,即得。4%氢氧化钠溶液：精密称取8 g氢氧化钠，溶解，定容至200 mL,即得。1%A1C13乙醇溶液：精密称取2 g氯化铝，定容至200 mL,即得。展开剂的配制：分别精密量取氯仿，甲醇，水，65 mL, 45 mL, 12 mL,混合即得。70%乙醇：精确量取 700 mL 无水乙醇，定容至 1000 mL。60%乙醇：精确量取 600 mL 无水乙醇，定容至 1000 mL

13、。2.4 黄酮类化合物标准曲线的制备由于芦丁和黄酮类化合物均是以 2-苯基色原酮为母核结构，具有相同的吸光度测试性质故用芦丁制作标准曲线。精密称取芦丁对照品5 mg置于50 mL容量瓶中，加入几滴无水乙 醇使其溶解，用 60%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得标准溶液。精密量取上述标准溶液0， 1.0， 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 mL,分别置于10mL容量瓶中，加入蒸馏水使成5 mL,精密加5%亚硝酸溶液0.3 mL,摇匀，放置5 min,再加10%硝酸铝溶液0.3 mL,摇匀，放置6 min,加4%氢氧化钠试液2 mL,各用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，放置10 min,以第一管为空白，在51

14、0 nm 处测定光密度值。2.5 盘龙参中总黄酮的提取取5 g粉碎好的经索氏提取去除色素的盘龙参于50 mL圆底烧瓶中，加入50 mL70%无水乙 醇回流1.5 h,提取23次，合并提取液。2.6盘龙参中黄酮类物质的提纯将回流液浓缩至30 mL左右，加入几滴稀盐酸进行酸化，摇匀。放置5 min,加入等体积的乙酸乙酯进行混合,萃取23次,合并萃取液。浓缩（精提液）,即得黄酮类粗提物,平行 三次。2.7黄酮类物质含量测定样品液5 mL于50 mL烧杯中，加入25 mL蒸馏水稀释，再加5%亚硝酸溶液1.5 mL,摇匀,放置5 min,再加10%硝酸铝溶液1.5 mL,摇匀，放置6 min,加4%氢氧

15、化钠试液10 mL, 放置10 min,定容，测定吸光度。将浓缩液定容至25 mL,取浓缩液1 mL于50 mL烧杯中，加入25 mL蒸馏水稀释，再加5% 亚硝酸溶液1.5 mL,摇匀，放置5 min,再加10%硝酸铝溶液1.5 mL,摇匀，放置6 min,加4%氢氧化钠试液10 mL,放置10 min,定容测定吸光度。2.8 盘龙参中黄酮类物质提取的工艺优化称取5.0 g粉碎过筛好的经索氏提取去除色素的盘龙参3份，分别置于50 mL圆底烧瓶 中，分别编号A、B、C。分别加入125 mL70%、75%、80%无水乙醇回流1.5 h提取，得粗 提液，使其体积为125 mL,量取5 mL,定容置2

16、5 mL,测定其吸光度。将回流液浓缩至50 mL左右，加入几滴稀盐酸进行酸化，摇匀。放置5 min,加入等体积的乙酸乙酯进行混合， 萃取23次，合并萃取液。浓缩，定容至25 mL,量取1 mL,定容至25 mL,测定其吸光 度，平行三次。称取5.0 g粉碎过筛好的经索氏提取去除色素的盘龙参3份，分别置于50 mL圆底烧瓶中， 分别编号A、B、C。分别加入75 mL、100 mL、125 mL65%无水乙醇回流1 h提取，得粗 提液，使其体积为75 mL、100 mL、125 mL,分别量取5 mL,定容置25 mL,测定其吸光 度。将回流液浓缩至50 mL左右，加入几滴稀盐酸进行酸化，摇匀。放置5 min,加入等体 积的乙酸乙酯进行混合，萃取23次，合并萃取液。浓