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1、胚胎干细胞体外培养（一）胚胎干细胞的来源目前胚胎干细胞的主要来源有：囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎 细胞；从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞 （embryonic germ cells，EG细胞），也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟 细胞；体细胞核转移（somatic cell nuclear transplantation, SCNT）至去核卵母细胞 后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。（二）胚胎干细胞的分离1. 分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来 确定ESCs分离获取的最佳
2、时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取35天囊胚；猪取9 10天囊胚；羊取78天囊胚；牛取67天桑葚胚或早期囊胚；人取710天囊胚。以 PGCs取ES细胞时：小鼠取12.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、 12.5天背肠系膜或13.514.5天生殖嵴；牛取2935天胎儿生殖嵴；人取3563天 的生殖嵴。2. 分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法， 即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。从囊胚分离ICM的方法主要有三种：（1）免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗 血清（抗H
3、-26）作用30分钟，移至1 ： 6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hanks液 冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性 杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。（2）组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但 延缓着床，46天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞， 在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下 用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Eva ns和Ka
4、ufma n采用这种方法第一个建立 了小鼠ESCs系。（3）显微外科学方法：小鼠受精后34天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接 从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而 显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组 织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增 殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。（三）胚胎干细胞的培养和建系ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提oESCs建系的原理是:将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其
5、未分化状态，这样代代相传从而使ESCs 成千上万的克隆。目前建立ESCs系的方法有多种，常用方法包括以下过程：原始ESCs 的获得：从受孕动物体内或体外受精卵培养中获得发育至桑葚胚或胚泡阶段的早期胚胎，用 机械法分离、胰酶或胶原酶消化桑葚胚或胚泡内细胞团得到原始ESCs悬液。ESCs的传 代培养：将原始ESCs悬液接种到经放射线照射或丝裂霉素C处理的成纤维细胞饲养层上 进行培养。培养1周左右，发现典型的ESCs集落，挑取细胞集落，用低浓度胰酶分散后, 进行传代培养，35天传1次。经反复传代培养，可获得生长旺盛的高纯度ESCs。ESCs 的鉴定。由于ESCs来源于分裂增殖非常活跃的早期胚胎细胞，
6、所以维持其生长代谢所需的营 养要充足，用于ESCs培养的饲养层细胞培养基含高糖和谷氨酰胺，同时加胎牛血清、新生 牛血清、2-巯基乙醇。高糖的作用是提高ESCs的增殖速度，同时提供饲养层细胞生长所 需的能量；谷氨酰胺作为细胞合成蛋白质与核酸的原料，是饲养层细胞培养基的必需品； 2-巯基乙醇的作用为促进胚胎细胞的分裂增殖，并可还原血清中的含硫化合物，防止过氧 化物对ESCs的损害。1胚胎干细胞的培养体系：(1) 常规培养液：选择和配制高质量的培养基是体外培养ESCs的基本要求。常用的培 养基有MEM-a、DMEM、TCM-199、F12等合成培养基，以DMEM应用最为普遍。再加 入10%新生牛血清
7、、10%胎牛血清、0.1mM 2-巯基乙醇、100pg/ml L-谷氨酰胺。 Thoms on等建立恒河猴(r hesus mon key)ESCs系时，培养基中补加了 1%的非必需氨 基酸，结果ESCs生长良好。Gardner和Lane发现，如果培养基中含有输卵管液中高浓 度表达的氨基酸成分，胚胎卵裂、囊胚形成和孵化均显著增加。(2) 无血清培养基：血清中含有大量促细胞生长因子和多种营养物质，有促进细胞生长繁殖和黏附的作用，但血清中还含有许多未知的成分和一些分化诱导因子，不利于ESCs 未分化状态的维持。为此人们尝试使用无血清培养液、化学合成培养液(chemicallydefined med
8、ium)进行ESCs的培养，加入刺激细胞生长的激素、细胞因子等，发现ESCs 增殖旺盛，且能保持未分化状态。(3) 条件培养基(co nditio ned medium, CM)： Mar tin曾应用小鼠畸胎瘤多能干细胞 系PSA-1的条件培养基建立了小鼠ESCs系，后Axel rod对其进行了改良：将PSA-1畸 胎瘤细胞接种于STO饲养层上,在含有10%胎牛血清的DMEM中贴壁培养，达到50% 75%汇合时更换培养液,用不含血清的DMEM培养基(加有10mg/ml转铁蛋白、10mg/ml 胰岛素)继续培养24小时，收集培养液，离心，去除细胞沉淀，上清液再经过0.22pm的 微孔滤膜过滤，
9、过滤后的PSA-1培养液再加入10%胎牛血清、0.1mM 2盃基乙醇，即为 PSA-1条件培养基。使用前用含有10%胎牛血清、0.1mM 2-巯基乙醇的DMEM培养基 稀释，PSA-1细胞分泌的细胞因子等活性物质的活性基本保持不变。以后许多实验室制备 了不同的条件培养基取代饲养层细胞来维持 ESCs的生长，如BRL(buffalo rat liver cells)、PC10-6R 转染的 COS 细胞、HBC-5637(5637 human bladder carcinoma cells)、RH-CM(大鼠心肌细胞条件培养基)等，这些条件培养基中都含有高浓度的细胞分化 抑制因子，可以抑制ESC
10、s的分化。(4) 饲养层(feeder layer)：饲养层是一层经过射线照射或丝裂霉素C处理后用作培养 ESCs的底物细胞层。饲养层细胞经射线照射或丝裂霉素C处理后，虽然失去分裂能力，但 仍能保持生存，并有同化培养液的能力，为胚胎发育提供一些必需因子，如成纤维细胞生长 因子、胰岛素样生长因子等促有丝分裂因子，LIF等细胞分化抑制因子，促进其增殖，抑制 其分化，而且可以除去体外培养环境中的毒素。目前常用的饲养层有：STO、PMEF(primary mouse embryonic fibroblast) SNL(G418R 基因和 LIF 基因转染的 STO)、HBC-5637 等。其中PMEF
11、以其易于取材、抑分化效果好等特点而被广泛应用。制备饲养层时，取达到80%汇合的原代鼠胚成纤维细胞，加入含10pg/ml丝裂霉素 C的培养液，作用24小时后，弃去培养液，用无Ca2+、Mg2+的Hanks液洗涤培养细 胞45次后，0.125%胰蛋白酶一0.02%EDTA消化制成细胞悬液，接种在涂有0.1%明 胶的四孔板中。安立龙等将小鼠ESCs置于衰老饲养层表面进行培养时发现，ESC集落松 散，表面及周围形成许多颗粒细胞、巨型细胞和上皮样细胞，认为衰老饲养层能诱导小鼠 ESCs的体外分化，所以建议使用新鲜制备的饲养层细胞来分离培养ESCs。2胚胎干细胞的获取：(1) 早期胚胎细胞培养法：早期胚胎
12、细胞培养法是将致密桑葚胚用0.3% EDTA将其离 散为卵裂球，并单个培养在STO(原代胎儿成纤维细胞)饲养层上，在培养4872小时后， 出现ESCs集落。(2) 胚胎与饲养层细胞共培养法：将早期胚胎如桑葚胚、囊胚、扩张囊胚等放置在铺有 STO或3T3饲养层细胞的培养液中培养，待胚胎贴壁、透明带脱落、ICM附着增生，出现 鸟巢状集落时，挑出ICM,消化ICM为细胞小块，用等体积培养液或胎牛血清中和胰蛋白 酶作用，将细胞小块接种在新饲养层上培养，就会获得ESCs。(3) ICM与饲养层细胞共培养法：用免疫外科手术法剥除滋养层细胞，以STO细胞为 饲养层，用ESCs条件培养基培养ICM细胞，也可获
13、得ESCs，剥除滋养层的主要目的是 防止滋养层细胞对ICM细胞的竞争抑制和诱导分化。(4) 原始生殖细胞与饲养层细胞共培养法：将原始生殖细胞PGCs接种于STO饲养层 细胞表面，可获得人ESCs。从人流产胎儿生殖嵴分离和克隆人ES细胞，克服了实验材料 难以取得的困难，这将会促进与人ESCs相关研究的进行。(5) 裸胚与饲养层细胞共培养：用玻璃针刺破囊胚或桑葚胚透明带，将有破口透明带的 胚胎置于培养液中培养，次日，ICM就从透明带中脱出贴附于饲养层。透明带坚固、厚、 不易破裂的动物胚胎贴壁缓慢，影响ICM增殖，切除透明带，有利于ICM增殖和ESCs 形成。而透明带薄，易于破裂的胚胎贴壁不受影响，
14、切除透明带等操作对ICM有不利影响， 使ESCs形成率降低。(6) 热休克处理胚胎与饲养层共培养：当胚胎在体内发育至2细胞或桑葚胚时，从子宫 中取2细胞胚胎或桑葚胚，将胚胎置于41C持续1小时，增加胚胎ICM细胞。采用热休 克处理胚胎，桑葚胚发育至孵化胚的效率为87%, 2细胞胚胎发育至囊胚的比率为85.0%。 在胚胎分裂的活跃期用热应激处理胚胎，阻制了胚胎分化，扩大了 ESCs分离的时间范围。(7) 切割胚胎培养：对早期胚胎进行切割，使胚胎一分为二。若2个半胚均含有ICM 和滋养层细胞，半胚可发育为扩大囊胚，大约有35%的半胚可贴附于子宫成纤维细胞滋养 层，且对以后的胚胎和胎儿发育无影响。这
15、表明，用切割半胚可以分离ICM和ESCs。(四) 小鼠胚胎干细胞分离培养的实验室技术由于ESCs在一般体外培养条件极易分化而失去其多潜能性特点，故需掌握一定的培 养技术才能保留其多向分化潜能和体外扩增两大特点。目前，以小鼠ESCs体外培养技术最 为成熟，本文将以小鼠ESCs为例，介绍ESCs体外培养和ESCs分离鉴定等实验技术。1培养基的准备：(1) ESCs培养液：以DMEM(高糖，葡萄糖含量要在4.5g/L以上)为基础液，加入以 下成分：NaHCO3 2.2g/L谷氨酰胺2mM非必需氨基酸O.ImM(3- 巯基乙醇 (B-me rcaptoetha nol)0.1mM或单硫甘油(mono
16、thioglyce rol)0.15mM庆大霉素50pg/ml或青、链霉素各100IU/ml(必要时可不加抗生素)15%胎牛血清(FBS)或10%胎牛血清+10%新生牛血清(NBS)LIF(leukemia inhibitory factor),可选择性加入，用饲养层细胞饲养ES细胞时， 可以不加，或加入5001 000IU/ml,无饲养层细胞饲养时要加1 000IU/ml以上。用超纯水或五蒸水配制，用HCI调pH7.4,过滤除菌，4C保存备用。目前GIBCO公司生产了一种KD-SRES细胞无血清培养液，可代替以上培养液使用。(2) STO及MEFs细胞培养液：DMEM(含葡萄糖1.0g/L即可)，10%新生牛血清， 青、链霉素各100IU/ml(或庆大霉素50pg/ml),三蒸水配制，过滤除菌，4C保存备用。(3) 胚胎培养液：M16或D
