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1、酵母培养操作规程本文主要介绍酵母的选育、保种、培养的操作工艺等。目 录第一章酵母扩培 （2）1-1 实验室扩培 （2）1培养基制备 （2）2接种操作 （3）1-2生产现场扩培（5）1准备工作 （5）2汉生罐接种操作 （5）3扩大罐扩培 （5）4二次（车间）扩大罐扩培 （6）第二章 菌种保藏 （7）1实验室菌种保藏与活化（7）2汉生罐菌种保藏与活化（7）第三章 酵母检测 （8）3-1取 样 （8）1扩培液、发酵液及待滤酒等的取样 （8）2酵母泥的取样 （8）3-2检 测 （10）1酵母细胞形态检测 （10）2酵母细胞大小测定 （10）3酵母泥外观检测 （11）4酵母细胞数和出芽率的测定（血球计数
2、板法） （11）5酵母死亡率的测定（血球计数板法）（12）6酵母肝糖染色法 （13）7酵母凝聚性的测定 （14）8酵母死灭温度的测定（15）9酵母发酵失重实验 （16）10酵母的呼吸缺陷型检测 （16）第一章酵母扩培1-1实验室扩培1培养基制备【试剂】：冷麦汁、蒸馏水、新鲜鸡蛋。【器具】：试管（15150）及（18180）、小巴氏瓶（三角瓶）、大巴氏瓶（大三角瓶）、卡氏罐、中速滤纸、电炉、量筒、不锈钢锅、糖度计等。【仪器】：杀菌锅、天平（精度0.1g）。【方法】试管、三角瓶及巴氏瓶培养基的制备取样：取糖化冷却麦汁，视麦汁浊度情况判定是否进行过滤。2，按每0.51L使用一个鸡蛋的比例，加入打成泡
3、沫的蛋清，在不断地搅拌下保温30min；然后升温煮沸30min；将煮沸后的麦汁用水浴冷至8090，用双层中速滤纸过滤。澄清：将麦汁加热至450.2P。调糖：将过滤后的麦汁用蒸馏水调整糖度为11分装：试管（15150）5mL，试管（18180）10mL，分装小巴氏瓶（三角瓶）、大巴氏瓶（大三角瓶）。灭菌：分装后包扎好，115杀菌20min；杀菌后培养基放置23天，确定无菌后备用。卡氏罐培养基的制备 取糖化冷却麦汁（有条件的可取薄板前热麦汁）加入卡氏罐，然后封闭卡氏罐取样口，各呼吸阀等接口处均应以棉塞或呼吸阀进行封闭后包扎结实，115杀菌3040min，于室温冷却至1718；接种前以3L/min的
4、速率充纯氧23min（卡氏罐有效容积20L）。2接种操作【器具】：酒精灯、酒精棉、剪刀、接种针、镊子、定量移液器或吸管等。【仪器】：超净工作台等。【方法】无菌室使用前，使用紫外线灯照射2030分钟进行杀菌；进入无菌室换无菌工作服；所有操作采用无菌操作。活化操作前将冷冻管菌种置于室温下，使之内部培养基达到室温后，振荡均匀；无菌操作，将冷冻管内的培养液全部转入盛有5mL培养基的试管中，于251培养722小时。将试管中的培养液轻轻振荡均匀，用接种环接取三环加入另一支盛有5mL培养基的试管中，于251培养2436小时。将培养结束的试管培养液轻轻振荡均匀，用无菌吸管接0.1mL加入盛有10mL培养基的试
5、管，振荡均匀后于251培养2436小时。扩大将培养结束的试管培养液轻轻振荡均匀后，全部接入小巴氏瓶（三角瓶），每个小巴氏瓶（三角瓶）接入一支试管的培养液；然后于231培养2436小时。将培养结束的小巴氏瓶（三角瓶）轻轻振荡均匀后，全部接入大巴氏瓶（大三角瓶），每个大巴氏瓶（大三角瓶）接入一只小巴氏瓶（三角瓶）的培养液；然后于211培养2436小时。将培养结束的大巴氏瓶（大三角瓶）轻轻振荡均匀后，全部接入卡氏罐，每个卡氏罐接入两只大巴氏瓶（大三角瓶）的培养液；然后于181培养2436小时。注：除卡氏罐外，其它液体培养基在接种后每12小时应振摇一次，以去除二氧化碳，保证酵母耗氧需求。【实验室扩培工
6、艺】容器扩大倍数培养温度培养时间hr冷冻管液体试管活化251722液体试管活化2512436液体大试管活化2512436小巴氏瓶（三角瓶）102312436大巴氏瓶（大三角瓶）102112436卡氏罐101812436注：1.试管至三角瓶阶段，至少多做1-2个（支）备用，防止出现意外情况，影响扩培。2.卡氏罐接种前充纯氧，充氧速率3L/min， 2-3min。1-2生产现场扩培1准备工作【设备准备】：每次扩培前应将待使用的自糖化至汉生罐、扩大罐的管路及汉生罐、扩大罐、连接管路、空气滤器进行刷洗和灭菌。【培养基灭菌】：取糖化冷却麦汁（有条件的可取薄板前热麦汁）加入汉生罐或扩大罐，进行升温杀菌。通
7、常在常压下保持沸腾3040min即可。杀菌后用无菌空气备压0.05MPa后降温至140.5备用。2汉生罐接种操作【接种】：将杀菌麦汁接入汉生罐后，再将已扩培好的卡氏罐菌种接种至汉生罐，扩培比例为1:1015。【通风】：保证酵母生长对氧的需求，具体通风量根据酵母生长情况调整，若酵母细胞内出现空泡较多或细胞拉长现象，应适当增减通风量。【温度】：接种前控温在140.5，接种后培养液自然升温至16，并保持160.5进行培养。【备压】：接种前备压0.05MPa，接种后保持罐内正压。【培养时间】：接种后培养3648hr，待细胞浓度达到3540106个/mL方可转罐。【检测】接种前的无菌麦汁及接种后的培养液
8、，应作微生物检测。3扩大罐扩培【接种】：扩大罐内接入冷麦汁（杀菌或不杀菌，保证麦汁无菌），将汉生罐内的培养液充分搅拌后，全部压入扩大罐（扩大比例1:56）。【通风】：具体通风量根据酵母生长情况调整，若酵母细胞内出现空泡较多或细胞拉长现象，应适当增减通风量。酵母起发后，应将流量和通风时间适当减少。【温度】：麦汁温度为120.5，自然升温至14，并于140.5控温培养。【备压】：接种前备压0.05MPa，接种后保持罐内正压。【培养时间】：培养2436hr，待酵母数达到3540106个/mL以上时，即可进行下一步扩培。4二次（车间）扩大罐扩培将扩大罐的培养液充分搅拌后，全部压入二次（车间）扩大罐（扩
9、大比例1:34）。再向二次（车间）扩大罐进充氧冷麦汁或对培养液进行适度通风（麦汁含氧量8mg/L以上），料温控制110.5，接种后自然升温至12，并于1112保温培养；压力维持罐内正压；培养242hr，待酵母数达到3540106个/mL以上时，即可进行追加麦汁或移入发酵罐进行繁殖。【车间扩大培养工艺】容器扩大倍数培养温度培养时间hr充氧状况卡氏罐汉生罐10151613648根据情况进行调节扩大罐561412436根据情况进行调节二级扩大罐34121242充氧麦汁浮选罐或发酵罐12101242充氧麦汁发酵罐追加满罐约1工艺控温242充氧麦汁第二章 菌种保藏1实验室菌种保藏与活化【形式】：保种形式
10、分为冷冻保种管和固体斜面保藏两种。冷冻保种管：青啤酵母以冷冻保种管的形式提供，-20-25保藏，一次扩培使用一支。固体斜面保藏：其它酵母菌种以固体斜面形式04冷藏保藏，定期活化；活化：每三个月活化一次。接一环斜面菌种于5mL麦汁液体培养基中，于251培养2436小时；待酵母起发后，将培养液振荡均匀，用接种环涂划固体斜面，于251培养6072小时；然后于04冷藏保藏。固体斜面菌种每年更换一次。2汉生罐菌种保藏与活化【保种操作】可将正在扩大培养的培养液由扩培罐压回至汉生罐，或直接将汉生罐的菌种留约1/5扩培液追加杀菌麦汁进行保种。培养4872小时后，至糖度降至78P时，迅速将温度降至24进行保种，压力为0.05MPa。每月更换一次麦汁进行活化，汉生罐菌种使用及活化次数总共不超过8次。【活化操作】将扩培罐麦汁杀菌降温至1213备用。将汉生罐内培养液通风搅拌后，全部转移至扩大罐中（扩大比1:56），于140.5进行培养，保持罐内正压，通风同扩培。待酵母数达到30106个/mL以上时，将待留种的培养液打回汉生罐，按【保种操作】条操作。剩余扩培液可打入发酵罐。第三章 酵母检测3-1取 样1扩培液、发酵液及待滤酒等的取样【器具】取样瓶、便携式喷灯、酒精喷雾器或酒精棉、打火机；【方法】
