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1、jacqueslm20232023-08-03 21:32来 dxy 好多年了，这些年陆间续续回复了一些帖子，可是回来回去，觉察大家提的问题，还是那么几个，没有从根本上有所提高，确实出乎意料。看过很多总结阅历的帖子，不知道该 如何评价，要么抄书本，要么人云亦云，缺乏自己的东西，手参考这些固然难获进益。实在受不了，这些混淆视听的东西，本人把这么多年的回复，略作整理完善拼凑成WB 实战指南，欢送行家批判指正。首先，摆摆自己的阅历。鄙人做WB 有 8、9 年了，平均下来两天跑一张多的蛋白胶；文章嘛，凑数的单篇有上24+，一作单篇 15+系国内完成；注：当年的IF，现在逐年递减没个标准。其次，由于一些
2、机缘的因素，在试验室WB 体系完善的过程中，很多靠自己摸索；说实话， 碰了一鼻子灰，差不多能遇到的问题都经受了，因此我敢写这样一个咚咚给大家共享。再次，我再强调一点，对我们这类人来说，试验结果的牢靠、秀丽已经不算一个要求；如何缩短操作时间，使试验进展的更有效率也是我们所追求的，因此本文会针对两个普遍承受的 却可以看成铺张时间的操作， Bradford 法蛋白定量和立春红染膜做特地批判，这在以前的WB 操作指南是绝无的，甚至叛离被视为经典的分子克隆。可是，请记住，经典是人定的。话不多废，开头：样品制备：变性条件SDS LB 直接裂解：用常温或者高温预热过预热更有利于阻挡蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化
3、，但简洁遗忘， LB 久煮某些性质会转变的1*SDS LB或者略高 1.5*直接加到细胞或者组织上并煮样。通常 6 孔板细胞 80%以上密度，需 200ul，其他按平板面积比类推。通常条件下，SDS LB 都是过量的因此不愿定要严格参考SDS LB 稀释比；假设 SDS LB 不够，样品核酸、蛋白浓度过高时，煮样后会觉察tip 吸不上来，格外粘、一砣一砣的，很简洁堵住tip。这时候常规做法有两种，1. 再煮 5min。常规煮样时间 3-5min，样品过浓时就煮 10min；2.假设 10min煮样后，照旧吸不起来，才适当增加SDS LB，连续煮；也可以对样品进展超声。煮样时间假设过长，蛋白会凝
4、固，此时以失去连续 WB 的意义，请丢弃推断标准：消灭明显的蛋白沉淀和水分层此方法的缺点，SDS LB 煮过的样品假设用来做IP，需要特别方法，因此， 这种制备方法制备的样品有使用局限。非变性裂解法不争论诸如核抽提、亚细胞器分别等等了，其实类似 裂解细胞请尽量冰上操作，减缓酶解作用。俺前 boss nature 文章上的裂解液配方是：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors (20 g/ml leupeptin, 10 g/ml pepstatin A
5、and 10 g/ml aprotinin)此裂解液可用于抽提核蛋白，其中蛋白酶抑制剂很简洁也很贵，其有用 0.5mM PMSF 替代这三种就好了；假设还要做磷酸化蛋白，加1mM Na3VO4现加现用，10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mM beta-GP。NP-40 =Nonidet P40乙基苯基聚乙二醇,乙基酚聚乙二醇醚 leupeptin：亮抑蛋白酶肽。pepstatin a：胃酶抑素a，aprotinin：抑肽酶 。PMSF：=phenylmethyl sulfonylfluoride苯甲基磺酰氟化物此方法的优点：NaCl 浓度略低于生理状态，保证裂解细胞的方式较
6、为温存，便于随后的IP10等试验。其他 Na 盐浓度的细胞裂解液也很常见，诸如 0.15M生理盐浓度、0.3M、0.6M高盐系列，裂解细胞时染色体会析出，细胞碎片和沉淀格外粘稠及 0.8-1.2M；0.3M 及以下适合IP 试验，0.6M 及以上适合纯化蛋白，尤其相互作用较强的复合体，要得到纯化的一些复合体的组成蛋白一般承受极端的高盐裂解细胞。用于核蛋白的裂解的缘由是 0.5% NP-40，用于破坏核膜构造；可用到1%，但此时染色体会析出，沉淀粘稠。组织块裂解：组织块较大用匀浆的方法最适宜，现在有不少转头很小的匀浆器。当组织超微量的时候，比方 50mg 颖癌组织，我承受的方法是1. 低温剪搅碎
7、，成肉糜状。2. 锡箔纸包裹好，放入少量液氮，快速敲击把握力气，尽量避开弄破锡箔纸，进一步裂开；反复屡次。3. 用上述细胞裂解液回收。分泌型蛋白富集：用无血清培育基培育细胞，收集上清液用于WB 检测；假设含量过低，需要用TCA 沉淀富集。理论上，从一般培育基中收集分泌蛋白，此时对细胞生长条件的影响最小，是最正确的试验条 件；但是这存在隐忧。由于含血清的培育基中含有格外丰富的 BSA牛血清白蛋白之类的蛋白质，除非你进一步分别纯化，否则直接用这种样品去 WB 会有格外大的麻烦，尤其当你的蛋白在 60-46 kDa 之间的时候；用“任何”抗体去检测这一区间的蛋白，会有一片格外强的信号。由于此区间蛋白
8、主要是 BSA浓度过于富集，会非特异性粘附“任意”抗体，从而最终被识别。同理，承受SDS LB 裂解细胞制备样品前，通常要用PBS 洗涤，其目的之一是去除培育基中的BSA。承受无血清培育基收集细胞上去除了转变细胞的生理状态外可能激活未知信号途径，诸如AKT 等，还会消灭的问题是：1. 即使承受了无血清收集上清，照旧有大量杂蛋白，但相对好很多。2. 选用了上清，由于蛋白浓度太稀，通常要承受TCA 沉淀富集，再重溶解。a. TCA 沉淀对半定量操作要求格外高，由于很简洁沉淀不充分或者离心操作丧失，尤其在离心过程，离心管的摆放格外讲究，要180 度翻转离心两次。b。重溶解时，由于蛋白需要在确定的盐离
9、子条件下才能重溶解，你要摸索充分溶解的条件，相对麻烦。实际上，假设你不是格外强调蛋白的分泌有什么生理功能，一般不建议检测上清，尤其半定 量的 WB 试验检测不同样品间的差异。这里面有试验操作细节的麻烦阅历之谈，我曾经参与的cancer cell 文章所争论的蛋白就是分泌型蛋白，但90%的数据是cell lysis；间或用到上清，也只是作为富集纯化该蛋白的原料，为进一步分析做预备。样品制备完，应马上低温保存-20 度短期几天；-80 度长期；例外，IP 用样品应直接进展 IP，避开冻融破坏蛋白质间弱的相互作用。SDS LB 煮沸过的样品冻融会存在另一个问题，SDS 沉淀；SDS 4 度就会沉淀，
10、何况-80 度。上样前应加热充分溶解，否则从加样口向下拖带SDS LB 不够，样品未充分溶解也会消灭类似拖尾；上样过大也会。在样品制备过程中，另一个需要留意的问题是，从样品制备的起始阶段就要留意定量问题；WB 本身系统误差有 20%，太微小的差特别常无视不计。细胞样品可以先计数再接种，短时间内即使细胞生长有差异也不会对 WB 结果影响太多。组织样品，从肿瘤组织的大小称重开头，裂解液的体积都是准确定量的，操作过程也尽量避开蛋白损失。有人会说可以电泳前蛋白定量，我将下一节争论蛋白定量的不科学性，以及裂解液成分对定量的干扰。【补充 1】：细胞有凋亡或生长速率差异时，有一个最直接的方法针对这个问题，实
11、际上将细胞收集下来以后，经过离心，去除PBS，这时候你可以拿出事先预备好的标准体积去比对，误差小于 50ul 的由于标准品差值可以设定为 50ul),所以根本上肉眼偏差至多只有 10ul细胞体积，这种小差异在 WB 结果中可以无视不计。其实标准品有多种好处，寻常可以用于离心时平衡；可以废物利用一些用过的effendorf 管。最好不要用纯水做标准品，我宠爱稀释一些SDS LB 做标准品，由于有蓝黑色比照下，可以更准确估量体积。这相比照测标准曲线，再一一读值还是快很多；蛋白电泳：电泳胶的制备、配方、缓冲液配方，请参考分子克隆。阅历之谈，8%胶最底边约 36KDa， 10%最底边约 25KDa，1
12、2%最底部约 12KDa。8%胶可以跑 300KDa-36KDa 之间的任意蛋白， 转膜效率对WB 结果的的影响都问题不大。12%，180KDa 左右，转膜效率对WB 结果的影响都问题不大300KDa 蛋白如何，没有尝试过。电泳一般承受恒流，45mA-55mA应依据电泳仪器适当调整，要留意仪器最高限压；此条件适合gibco model V16 型，胶宽 20cm。承受恒流的优点，保证最快速度完成电泳电压会渐渐增大，省时且削减集中；但是由于电泳速度过快时会发热而溶胶，所以你必需想方法散热。散热不好，条带消灭波浪状。留意事项：1. 聚丙烯酰胺的 30%母液会降解，要 4 度避光保存。2. APS
13、会失效，10%APS 一般保质期才一个月左右。-20 度分装长期保存。3. 留意Tris buff 的PH 值，以及寻常所用的水的PH 值。PH 值转变会使带型格外怪异，全部蛋白和溴酚蓝压成一条细线即便在分别胶中，假设溴酚蓝前有红色染料，那么此染料彗星式拖尾从溴酚蓝始终延长到胶底部溴酚蓝此时涌动极缓慢，位于胶中上部 4上下层式电泳装置假设漏液，哪边漏液，电泳条带往哪边倾斜。内外式电泳装置漏液，则装置处于短路状态，液体会过热。SDS- 胶可能局部自溶，条带扭曲、变形。5. 配胶用玻璃板和边条应准时洗净。玻板未洗净的害处很多。尽管玻璃看似平滑，但是一 些微小的凹陷处会分散肉眼无法区分的胶颗粒摸上去
14、疙疙瘩瘩，其害处是，在该部位极易导致不均匀的胶块，样品经过该处或电泳散热不好，条带变形。假设是 RNA 的超薄胶， 胶板的颗粒会导致局部巨大气泡，格外难于去除；蛋白胶也会导致一些小气泡的产生。玻板 没洗净的另一个害处是，由中学物理学问可知，玻璃外表越光滑粘附越牢，未洗净的玻板会 减弱和胶体间的粘附力，拔梳子或边条时会产生微小的错动，胶体下部消灭大量气泡夹在 玻板和胶之间，这个关系不大；严峻的错动会使上样时，样品从胶和玻璃之间的间隙漏光， 或者甚至胶和玻板分开。为避开拔梳子时的错动，可在电泳缓冲液中拔梳子比水更好，有SDS 润滑。推断玻板是否洗干净，用手摸一下有没有疙疙瘩瘩的；最好用洗洁精之类，
15、洗衣粉、肥皂都不好用。6. 上样时，不要把tip 深入胶孔过深或者承受细的尖端拉长的专用上样枪头，可能会错开胶和玻板，样品会泄露。7. 未加样的孔应添加高浓度 SDS LB 平衡，否则最外侧条带会拉宽变形。通常 20ul 样品含5ul 4*SDS LB，可用8-8.5ul 4*SDS LB 平衡。同理，点marker 的 lane 也要参与同样体积的 LB。LB 假设在室温放置太久和颖的在比重上会有差异，在旧LB 靠近的地方，条带会拉宽或挤压变形。因此，同一块胶上，煮样及填空白所用LB 应全都。LB 应-20 度保存。8. 增加上样量不愿定会提高荧光信号强度。增加上样量的后果通常只能是让你的内参粘连 ，全部的蛋白条带都扭曲变形。由于增加上样量最多只能提高几倍，而WB 灵敏度是以 10 的几次幂量级的，全部目的蛋白信号的唯一方案就是IP 富集可特异提高目的蛋白浓度数百数千倍，并去除其它杂蛋白干扰。增加上样量的另一个害处是，原来高表达的蛋白，诸 如内参，在同样WB 条件下，可能消灭荧光灼烧式粹灭一晃而灭或者条带中空。仍以 6 孔板 80%以上集合度为例，细胞裂解液和SDS LB 通常都是投入 200ul最少 80ul， 这样面积的培育板假设裂解液投入太少，回收时的损失就太大，上样就很难做到全都，而这
