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1、微生物遗传与分子生物学（5*15+1*25=100分）本课程主要涉及到微生物中主要的模式菌株:原核微生物: 放线菌(链霉菌),大肠杆菌,芽孢杆菌,乳酸菌，古菌等。真核微生物：汉逊酵母，酿酒酵母，白念珠菌等。第一章 概论基因的符号：每个基因：如色氨酸基因trp；同一表型的不同基因：如trpA或trpB等。当染色体上发生缺失时可用表示（如trpA或trpA）；基因突变：如亮氨酸缺陷型leu-；抗药性基因：r表示抗性，加s表示敏感如链霉素抗性基因表示为strr，敏感基因表示为strs。1、 微生物基因突变一般分几种类型,突变有什么生物学意义?（谭老师）基因突变可从突变发生方式和突变引起的表型改变和遗
2、传物质改变等方面进行分类。按突变体表型特征的不同，可把突变分为以下4个类型:1). 形态突变型2). 生化突变型3). 致死突变型:按突变所引起的遗传信息的改变，又可把突变分为：1). 错义突变 2). 同义突变3). 无义突变 根据遗传物质的结构改变，可分为碱基置换、移码、DNA片段插入和缺失。根据突变发生的方式，可分为自发突变和诱发突变。突变的生物学意义：基因突变导致了基因表达出来的性状发生了改变，对突变个体本身来讲，绝大多数是有害的，因为现有的生物基本上都适应了现在的环境。但是环境是可变的，如果生物不变，那就很可能被淘汰。所以，对整个生物群体来说，突变使群体不会灭亡。环境不断改变，生物通
3、过不断突变而适应, 也就使其被保存下来。最终，物种的面貌特征与祖先不同，所以说，突变是生物进化的内因，是进化的主要动力。 无数事实说明了一个真理，即宇宙间的所有物种变是绝对的，不变则是相对的。2、 应用于链霉菌基因组编辑与大片段DNA克隆的技术都有哪些？能否用在你们今后的实验中？（刘钢老师） 基因组编辑是指在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到改造基因组的目的。链霉菌基因组编辑有：l I-SecI endonuclease介导的同源重组系统：敲除质粒上含有一串
4、联的与靶片段左右臂同源的两个DNA片段以及I-SecI识别的18个碱基的位点（sceS）。将该质粒导入链霉菌细胞，并通过抗性筛选质粒插入到基因组上的克隆。如果发生同源单交换，该质粒将被完整导入基因组靶位点。通过诱导表达SecI，SecI在18个碱基的位点（sceS）切断基因组DNA，菌体不能够存活。如果发生同源双交换， sceS被删除，即使诱导表达SecI也不会造成基因组DNA的断裂，菌体仍然存活，并表现出抗性敏感。l CRISPR-Cas9介导的同源重组系统：首先优化cas9的密码子，将其放置在强启动子之后并克隆到敲除质粒上，敲除质粒上含有sgRNA并置于组成型启动子之后， sgRNA中的引
5、导序列为靶位点的同源序列，敲除质粒必须包括靶基因两侧的同源臂。将该质粒导入链霉菌，CRISPR/Cas9系统将靶位点切断，同时质粒上的同源臂与基因组上的同源臂发生双交换，将断裂的靶基因区删除，基因组重新连接。（CRISPR/Cas9系统先切断靶序列后直接发生双交换，最后断裂的靶基因直接被敲除）l 位点特异性整合酶介导的基因组编辑：（cre/lox系统）利用两次同源单交换分别将两个loxP位点整合到目的基因片段的上下游，再将Cre蛋白表达质粒导入链霉菌，在Cre蛋白的作用下，两个loxP位点发生位点特异性重组，完成目的基因片段的敲除。而环化的DNA由于不能在链霉菌中复制，随着传代而丢失。大片段D
6、NA克隆的技术：l 依赖于酵母菌的转化介导的大片段DNA重组克隆（TAR）l 基于FBT1 attp-attB-int整合系统的链霉菌基因组DNA大片段克隆技术：通过结合转移将质粒pSV:attB6Up导入链霉菌，卡那霉素筛选获得pSV:attB6Up同源整合到目的位置的菌株S-attB6。再将pKC1139:attP6Dn导入S-attB6，在40度培养， pKC1139:attP6Dn通过同源单交换整合到目的位置获得S-attB6P6。通过结合转移将含有FBT1整合酶的pIJ10500导入S-attB6P6中，利用整合酶将目的基因簇环出，并克隆到载体pKC1139上。在今后的实验中可能会用
7、到： 我们实验室是分子生物学实验室，这些技术方法对于我今后的研究室有助益的。我们平时多采用基本的遗传操作，构建敲除质粒载体，然后导入受体菌株进行同源重组进行单交换，利用抗生素进行筛选，随后还需要进行双交换。我们可以考虑使用基因编辑技术来进行遗传操做。比如应用CRISPR-Cas9介导的同源重组基因编辑技术来使之直接发生双交换而直接敲除靶标基因，这样操作起来并不繁琐，也省去了些过程，并且对是否发生双交换也比较好判断。3、 作为丝状细菌的链霉菌经历一个怎样的分化过程？对其自身有何意义？（刘钢老师）作为丝状细菌链霉菌的分化过程为：1，孢子萌发形成基质菌丝；2，基质菌丝延伸、分枝；（光秃表型）3，向空
8、气中生长形成气生菌丝；4，气生菌丝产生螺旋和分隔；（白表型）5，分隔加深形成孢子链；6，孢子链变灰，成熟；（灰表型）7，释放游离孢子。 链霉菌的发育分化过程中有部分的基质菌丝和未分化成为孢子的气生菌丝存在有死亡现象，这些菌丝的死亡发生在链霉菌分化过程中的特定时间和区域。，首先是死亡的菌丝体并未显示出PCD所特有的表观特征，其次是死亡的菌丝体并未完全消失，保留的残体既可以作为机械支撑用于气生菌丝分化从而脱离培养基表面，同时也可作为水分和营养物质的运输通道。 对其自身的意义：营养生长阶段，基质菌丝经过顶端生长和分支，在感受到环境中的营养限制或者其他压力后，以应对环境胁迫，链霉菌通过bld基因级联信
9、号通路产生疏水分子SapB，从而赋予菌丝表面疏水特性而使其突破培养基表面的气-水张力进入繁殖性的气生菌丝阶段，然后又通过whi基因等的级联信号通路控制下产生孢子，孢子成熟后飘落到适宜的环境中在进行上述过程生活。这种分化过程可以赋予链霉菌抵御环境胁迫的能力。进行生殖生长产生气生菌丝和孢子，成熟孢子随风或其他生物带到更加适宜其生活的环境中，对于链霉菌自身是十分重要的生活方式，使之区别物其他的原核生物，所以这种发育分化过程对于链霉菌自身意义重大。链霉菌发育分化中的细胞死亡过程其生理学意义可能在于：当链霉菌在生长过程中感受到环境中的营养限制或者其它压力时，通过细胞死亡可为其孢子形成提供营养物质，伴随着
10、基质菌丝向气生菌丝的转变，链霉菌通常会在这一时期产生抗生素，这对于链霉菌专一性的重新利用自身裂解产物可能具有重要的意义。链霉菌发育分化和次级代谢产物的合成一般都是起始于对环境中营养匮乏的感应。4、 链霉菌为什么会产生如此多样性的次级代谢产物？他们对链霉菌本身有何意义？（刘钢老师） 次级代谢产物通常是指不是生物体生长发育所必需的分子量小于3KDa的小分子物质。越来越多的证据表明，次级代谢实际上参与了生物体对环境因子应答等多种生理作用。广泛意义上的抗生素囊括了几乎所有的微生物次级代谢产物，这些次级代谢产物在极低的浓度在生化水平调控微生物的生长过程。 抗生素是逐步合成的代谢产物, 每一步都需要约10
11、 一30 个基因来决定其结构和起自我保护作用抗性基因, 以及控制结构基因活性的调控基因, 并使它们随特性生存需要给予表达; 这常常与活性营养生长和抱子形成之间的转变相一致。链霉菌产生的次级代谢产物对其本身的意义：当链霉菌在生长过程中感受到环境中的营养限制或者其它压力时，伴随着由基质菌丝形成气生菌丝，菌体周围的营养物质逐渐被消耗，链霉菌开始降解自身的基质菌丝为形成繁殖型的气生菌丝提供营养，同时各种次级代谢产物（抗生素）开始产生，而次级代谢产物可以帮助链霉菌抵御环境胁迫，从而创造利于自身生活的环境。这对于链霉菌专一性的重新利用自身裂解产物可能具有重要的意义。这些次级代谢产物在极低的浓度下，可以在生
12、化水平调控微生物的生长过程对菌体的生长也具有重要的生物学意义。抗生素还具有抑制它种微生物生长活动、甚至杀灭它种微生物的能力，这就为链霉菌的生活创造了相对较好的条件。5、 调控基因在抗生素生物合成中有何主要功能？ 抗生素生物合成基因簇一般由调控基因、结构基因和相关抗性基因组成，而且这些基因总是成簇排列。在抗生素生物合成中调控基因起到了一个开关的作用, 它可决定一种抗生素能否被合成、什么时候合成和什么时候被终止的精细调控作用。1. 抗生素生物合成的途径特异性调控：链霉菌的次级代谢产物生物合成基因簇通常成簇排列，包括一个或多个调控基因，一般只负责调控所在基因簇基因表达的调控称之为途径特异性调控。途径
13、特异性调控蛋白如SARP蛋白，SARP蛋白都含有OmpR类的DNA结合结构域和转录激活结构域，通过招募RNA聚合酶到靶基因的启动子上游激活基因的转录。大多数SARP蛋白都是途径特异性调控子，一般只调控与其相邻的基因。2. 全局性调控：相对于链霉菌次级代谢中的其他调控模式而言，全局调控是一种更为多样、普遍、复杂的调控模式。全局调控基因可以调控多条次级代谢途径。全局性调控蛋白对抗生素生物合成的调控通常是通过直接或间接地调控途径特异性调控蛋白实施的。而除了调控次级代谢产物的生物合成外，很多全局调控蛋白还控制着链霉菌的形态分化，还有一些能够调控初级代谢，并成为初级代谢向次级代谢转换的媒介。Eg. 双组
14、份信号转导系统、AdpA3. 抗生素生物合成的自调控-反馈调控和前馈调馈：（抗生素介导的自调控）反馈调控: 指一种微生物代谢反应的终产物在代谢合成过程中对合成基因簇中调控基因或生化反应关键酶基因的调控 (如抗生素)。前馈调控：指一种微生物代谢反应的底物或中间物在代谢合成过程中对合成基因簇中调控基因或生化反应关键酶基因的调控。l 抗生素作为终产物介导的自调控系统可取代双组分系统中通过磷酸化作用的应答调控机制，并证明这种新调控机制在微生物次级代谢生物合成中是广泛存在的。6、 链霉菌信号分子有哪几种类型, GBL类型的信号分子在抗生素生物合成中如何发挥其功能? 菌群群体反应感应信号分子-当信号分子达
15、到阈值-启动特定基因表达-改变和协调细胞间行为使群体呈现某种生理特征。链霉菌信号分子的类型：高丝氨酸内酯(HSL)、自诱导肽(AIP)、AI-2、-丁酸内酯(GBL)、DSF、PQS、法尼醇等。目前研究得最多的群体感应系统有以下四种：革兰氏阴性菌中的酰基高丝氨酸内酯(AHL)介导的群体感应系统、革兰氏阳性菌中的自诱导肽(AIP)介导的群体感应系统、呋喃硼酸二酯结构的AI-2介导的种间群体感应系统和-丁酸内酯(GBL)介导的群体感应系统。GBL类型的信号分子在抗生素生物合成中发挥功能：链霉菌广泛使用-丁酸内酯（GBL）类化合物作为自调控因子。GBL在胞内合成并分泌到胞外，当达到一定阈值浓度时，能够被胞内的受体蛋白所感知，从而引起群体反应(抗生素合成或产孢)。信号分子（A因子GBL）的受体蛋白ArpA与多效调空基因adpA的启动子区结合, 阻遏了adpA的转录。当A因子（GBL）积累到阈值时，它与ArpA结合，使ArpA从adpA上解离，导致adpA有效地进行转录。翻译后的AdpA控制链霉素生物合成基因簇中调控基因strR的转录, StrR激活strB1开始的这个转录单元的基因转录, 从而调控链霉素的生物合成。7、 有哪些方法或策略可以得到新型抗生素?1. 更多链霉菌基因组的测序及挖掘：随着更多链霉菌基因组的不断完成和信息积累,
