食品微生物学实验指导书

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1、食品微生物学实验指导书食品科学与工程学院 食品工程教研室2014年10月实验一 培养基的设计与配制 一、目的要求1学习并掌握微生物培养基的概念和设计思路。 2学习并掌握配制微生物培养基的一般方法和步骤。3. 学习并掌握棉塞的制作方法。二、培养基的设计与配制原理培养基是人工配制的各种营养物质供微生物生长繁殖的基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加上实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，但不论是何种培养基，均应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐等。不同微生物对pH值要求不一样，所以配制培养基时，还应根据不同微生物对pH值的要求，

2、将培养基调到合适的pH值范围。三、实验材料和用具牛肉膏，蛋白质，琼脂，可溶性淀粉，葡萄糖，孟加拉红，链霉素，10NaOH，10HCl，1molL NaOH，lmolL HCl，KNO3，NaCl，K2HPO43H20，MgSO47H20，FeSO47H2O；试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，天平，牛角匙，pH试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，纱布， 四、操作方法与步骤 (一) 培养基的配制1牛肉膏蛋白胨培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基是一种普通而又应用最广泛的细菌基础培养基。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂1520g，水1000mL，pH值7.47.6。(1)称量和溶解 药

3、品实际用量计算后，按培养基配方逐一称取牛肉膏、蛋白胨等营养成分依次放人烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒人大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。(2)加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放人已溶解的药品中，再加热溶解，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补充所失的水分。(3)调pH值 检测培养基的pH值，若pH值偏酸，可滴加1molL NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检

4、测，直至达到所需pH值范围。若偏碱，则用1molL HCl进行调节。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。(4)过滤 液化培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，去除杂质便于观察。但是供一般使用的培养基，可省略过滤步骤。(5)分装 按实验要求，将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上造成污染（见实验图1-1 ）。分装量：固体培养基约为试管高度的15，灭菌后制成斜面，分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜；半固体培养基以试管高度的13为宜，灭菌后垂直待凝。(6) 加棉塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞(

5、或泡沫塑料塞或试管帽等)，以阻止外界微生物进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性能。(7)包扎 加塞后，将全部试管用麻绳或橡皮筋捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸(有条件的实验室，可用市售的铝箔代替牛皮纸，省去用绳扎，而且效果好)，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳或橡皮筋扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。(8) 灭菌 将上述培养基以O.103MPa，121，20min高压蒸汽灭菌。(9) 搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷至50左右(以防斜面上冷凝水太多)，将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜(实图7-2 )。 (10)无菌检查

6、将灭菌培养后的培养基放入37的恒温箱中培养2448h，以检查灭菌是否彻底。2高氏1号培养基的配制 高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：可溶性淀粉20g，KN03 1g，NaCl 05g，K2HP043H2O 05g，MgSO47H2O 05g，FaSO47H2O 001g，琼脂1520g，水1000mL，pH值7476。(1)称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再将其加至少于所需水量的沸水中，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解，再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO47H2O，可先配成高浓度的贮备液后再加入，

7、方法是先在100mL水中加入1g的FeSO47H2O，配成浓度为O01gmL的贮备液，再在1000mL培养基中加入以上贮备液1mL即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同“牛肉膏蛋白胨培养基的配制”。(2)pH值调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同“牛肉膏蛋白胨培养基的配制”。实图1-1 培养基漏斗分装装置 实图1-2试管的包扎方法1一 铁架；2一漏斗；3一乳胶管；4一弹簧夹；5一玻管 3马丁氏培养基的配制 K2HPO4 1g，MgSO47H2O 05g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂1520g，水1000mL，自然pH值。(1)称量和溶解 先计算

8、后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需量的水中。待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。再将盂加拉红配成1的水溶液，在1000mL培养液中加入1孟加拉红溶液33mL，混匀后，加入琼脂加热溶解，方法同“牛肉膏蛋白胨培养基的配制”。(2)分装、包扎、灭菌及无菌检查同“牛肉膏蛋白胨培养基的配制”。(3)加入链霉素 由于链霉素受热易分解，所以临用时，将培养基熔化后待温度降至45左右时才能加入。可先将链霉素配成1的溶液，在100mL，培养基中加入1的链霉素03mL，使每毫升培养基中含链霉素30ug。4豆芽汁葡萄糖培养基的配制 豆芽浸汁(1)100mL，葡萄糖5g，琼脂152g，自然pH值。(1)

9、 称量和溶解先称量琼脂，加热溶解，然后加入葡萄糖，待溶解后，与豆芽汁混合。(2) 分装、包扎、灭菌及无菌检查同“牛肉膏蛋白胨培养基的配制”。(二) 棉塞的制作棉塞的作用有二：一是防止杂菌污染；二是可过滤空气，保证通气良好，并可减缓培养基水分的蒸发，所以正确地制备棉塞是培养基制备中重要的一环。正确的棉塞是形状、大小，松紧应与试管口(或三角烧瓶)完全适合。过紧则妨碍空气流通，操作不便；过松时，空气会毫无障碍地进入试管(或三角烧瓶)中，达不到灭菌的目的。棉塞过小往往易掉进试管内，因此棉塞质量的优劣对实验的结果有很大的影响。正确的棉塞头较大，加塞时，应使棉塞长度的13留在试管口外，23在试管口内（见实

10、验图1-4）。目前，有条件的实验室已使用坚固的塑料试管帽、金属试管帽、硅胶泡沫塞替代棉塞，制作棉塞要选纤维较长的棉花，一般不选用脱脂棉。因为它容易吸水变湿，造成污染，而且价格也贵。棉塞制作方法见图1-5 实图1-4棉塞 实图1-5 棉塞的制作方法（三）斜面与平板培养基的制作斜面与平面培养基是常用的琼脂固体培养基。将熬制好的琼脂培养基趁热装入试管灭菌后摆鞋面，凝固后即成斜面培养基。斜面培养基常用于菌种培养、菌种保藏等工作。将灭菌后的琼脂培养基倾注于无菌培养皿中，凝固后即成平板培养基。平板培养基常用于分离菌种、菌落计数、菌落形态观察及菌种鉴定等。斜面与平板培养基的制作过程大致为：溶解原料、融化琼脂

11、、调pH、分装、灭菌和制斜面或平板。1、 溶解原料为加速原料的溶解，最好用热水。先将原料依次加入到占配制量一半的水中，待全部溶解后在加足水量。如配方中有马铃薯、麸皮、胡萝卜、豆芽等天然原料，需将其熬制约30min，取出定量滤液，在将所需的其他原料加入滤液中。 2、融化琼脂 琼脂的用量可灵活掌握。用作保藏菌种的培养基，琼脂用量可提高至2.5%，以增加持水性。冬季的气温低，琼脂用量可适当减少。琼脂条用前可剪成小段，以利于融化。待溶液煮沸时再加入，不断搅拌至完全无琼脂块状物时再停止加热。 3、调整pH 用洁净干燥的玻璃棒沾一点培养基滴在试纸上，立即与比色板比较。一般用10%NaOH或HCl调节。 4

12、、分装 将培养基趁热倒入垫有纱布的漏斗中，使培养基直接滤至试管或三角瓶中，试管装量一般为管高的1/4左右，三角瓶的装量约为其容量的一半。勿使培养基玷污容器口部。口部塞有棉塞，试管每7或9 支扎一捆，棉塞外面包牛皮纸，以防在灭菌过程中被水汽打湿。5、灭菌分装后的培养基应随即灭菌。除特殊情况外，一般培养基均用高压蒸汽灭菌，在104kPa压力下，灭菌20-30min 。6、制作斜面或平板将灭菌后的试管趁热斜置于棍条上，倾斜度以试管中的培养基约占试管长度的1/2为宜，凝固后即成斜面培养基。待灭菌后三角瓶内的培养基冷却至4550时，以无菌操作法向无菌培养皿中倒入培养基，装置以刚覆盖整个培养皿底部为宜（约

13、15ml）,凝固后即成平板培养基。五、思考题1培养基根据什么原理配制成?牛肉膏蛋白胨培养基中不同成分各起什么作用? 2配制培养基有哪几个步骤?在制备培养基的过程中应注意些什么问题? 为什么?3记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。4培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?已灭菌的培养基如何进行灭菌检查?实验二 干热和湿热灭菌-玻璃器皿和培养基的灭菌一、实验目的1学习并掌握各种灭菌方法的操作步骤。2熟悉玻璃器皿的包扎方法。3掌握高压蒸汽灭菌技术。二、实验器材pH试纸、培养皿、试管、移液管、锥形瓶、烧杯、量筒、培养基分装器、高压蒸汽灭菌锅、酒精灯、纱布、棉花、牛皮纸(或报

14、纸)、玻璃棒、天平、牛角匙、记号笔。三、方法与步骤1玻璃器皿的洗涤和包装(1)洗涤玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放人烘箱中烘干、备用。(2)包扎移液管包装将干燥的移液管的吸端用细铁丝塞入少许棉花构成115cm长的棉塞，以防细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内。棉塞要塞得松紧适宜，吸时既能通气，又不致使棉花滑人管内。将塞好棉花的移液管的尖端，放在45cm宽的长纸条的一端，移液管与纸条约成30夹角，折叠包装纸包住移液管的尖端，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式

15、地包在移液管外面，余下纸头折叠打结。包好的多个移液管可再用一张大的报纸包好。试管和三角瓶等的包扎 用棉塞或泡沫塑料塞将试管管口和锥形瓶瓶口部塞住，然后在棉塞与管口和瓶口的外面用两层报纸与细线(或用铝箔)包扎好，放在铁丝或铜丝篓内待灭菌。培养皿的包扎 培养皿由一底一盖组成一套，用牛皮纸或报纸将培养皿(皿底朝里，皿盖朝外)包好。如果将培养皿放金属筒内进行干热灭菌，则不必用纸包。 空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若用湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎，外面最好加一层牛皮纸或铝箔。2干热灭菌法 干热灭菌法适用于玻璃器皿，如试管、培养皿、三角瓶、移液管等的灭菌。(1)装入待灭菌物品 预先将各种器皿用纸包好或装入金属制的培养皿筒、移液管筒内，然后放人电热烘箱中。(