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1、免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包 括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察 到荧光，以下主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。【zoT的免疫荧光】步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。2、用预温的1 Xpbs洗脸3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1Xpbs洗脸3次，每次10分钟5、0.2%tritonx-100 透化 2-5 分钟6、1Xpbs洗脸3次，每次10分钟7、5%bsa室温封闭30分钟8、加一抗（用1 %bsa吸收）放到烫盒里，4渡过夜9、1Xp
2、bs洗3次，每次10分钟10、加二抗（用1 %bsa吸收）30分钟，闭光11、1Xpbs洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2% tri ton, 5%bsa 均用 1 Xpbs 稀释从大鼠拆分的t细胞若想轻易搞细胞免疫荧光【细胞爬片的免疫荧光】步骤：1. 取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，pbs洗三遍。特别注意：有的时候并作的细胞爬片可能将比较大，因此托盘的时候必须小心，特别 注意反正面，放到皿里洗脸比较便利，防止了往复托盘，另外洗脸的时候提pbs不要太冲, 不要细胞流下来。洗脸的时候我都就是多提pbs，稍伸一下就死掉，没等5分钟或10分钟。2.4%
3、冷的多聚甲醛固定20分钟，pbs洗三遍。3.0.2%tritonx-100通透10分钟，pbs洗脸三遍。4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，pbs洗三遍。5. 抗炎4度烫盒内过夜，也可以37度2小时，感觉前者效果不好，pbs洗脸三遍。6. 二抗室温2小时（避光），或者37度1半小时，pbs洗三遍。7. 最出色用dapi染核，然后轻易照荧光片。8蒸馏水洗掉pbs，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干， 所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。建议：1. 还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照 反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。2.
4、荧光的片子一定必须贮藏留存，留存的不好的话，过一段时间仍然能照出来较好的 片子。3. 二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异 性荧光光点，非常难看。【细胞免疫荧光】简单实验步骤如下:1. 冲洗血清蛋白h7.2-7.437度pbs2小时.2. -20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥10分钟3. pbs 晒干：3min*34.1%triton:25min30min.酉己成 50ultriton+5mlpbs5. pbs 晒干:2*5min6. 羊血清封闭：37度， 20分钟7. 一抗炎，4渡过夜，通常必须大于18小时或者37度 1-2小时8.4 度 pbs 洗净，3min*5 次9.二抗炎 37度大于一小时10.37 度 pbs 洗净，3*5min肥干活封片（封闭液ph8.5）不管采用何种方法，在使用pbs缓冲液漂洗时，都要漂洗干净并且要测下ph值，可 以使用pbs多清洗几次，也可以延长pbs清洗时间，如果结果背景较高可以延长漂洗的次 数和时间。
