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1、选修三 现代生物科技专题专题一 基因工程基因工程：指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过“体外DNA重组和转基因”等技术，赋予生物以新的“遗传特性”，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此，又叫做“DNA重组技术”。第一节 DNA重组技术的基本工具一、限制性核酸内切酶分子手术刀（简称限制酶）1.来源：从原核生物中分离纯化而来。2.特点：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。3.作用部位：磷酸二酯键4.作用实质：使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
2、5.作用结果：产生黏性末端或平末端6.六种酶的比较：实质模板作用部位作用结果限制酶切割目的基因或载体不需要磷酸二酯键形成黏性末端或平末端DNA连接酶催化两个双链DNA片段连接起来不需要形成重组DNA分子DNA聚合酶催化脱氧核苷酸单链与单个脱氧核苷酸连接需要（DNA单链）形成新的DNA分子DNA水解酶催化DNA分子水解不需要形成脱氧核苷酸DNA解旋酶催化DNA分子双链解旋不需要碱基对间的氢键形成单链DNA分子RNA聚合酶催化RNA的合成需要（DNA单链）磷酸二酯键形成新的RNA注解：（1）基因重组的三种类型：基因的交叉互换：减I前期；基因的自由组合：减I后期；基因工程：可定向改造生物性状。（2）
3、对限制酶的理解：限制酶是一类酶，而不是一种酶；限制酶的成分均为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强碱或强酸均易使之变性失活；限制酶作为酶类，其催化作用具有高效性、专一性和作用条件较温和等特点；限制酶主要来源于原核生物，如细菌；在原核细胞内，限制酶起切割外源DNA，防止寄生生物侵染的作用。二、DNA连接酶分子缝合针1.类型：根据酶的来源不同，可分为：Ecoli DNA连接酶（从大肠杆菌中获取）和T4DNA连接酶（从T4噬菌体中获取）。2.作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。3.特点：Ecoli DNA连接酶只能连接黏性末端，T4DNA连
4、接酶既能连接黏性末端又能连接平末端，但连接平末端的效率较低。三、基因进入受体细胞的载体分子运输车1.作用：将含有外源基因（即目的基因）的DNA片段结合，将外源基因送入受体细胞中。2.载体必须具备的条件：（1）有一至多个限制酶切点（方便目的基因插入）（2）能自我复制（使目的基因在宿主细胞中能保存下来并能大量复制）（3）有特殊的标记基因（对导入目的基因的受体细胞进行检测与筛选）3.载体的种类（1）质粒：是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外的，具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。质粒是最常用的载体。（2）其他载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒等注解：天然质粒需要经过人工改造后，才
5、能用作基因工程中的载体；基因工程中的载体与细胞膜上的载体蛋白的区别基因工程中的载体细胞膜上的载体蛋白来源细菌的质粒、噬菌体、动植物病毒细胞膜上的蛋白质作用将目的基因转移到宿主细胞中，并能在宿主细胞中对目的基因进行大量复制运载要进出细胞的某些物质对限制酶和载体切割位点的说明a.若用于切割载体的限制酶有多个切点，则切割后载体可能丢失含有复制起始点的片段，重组DNA分子进入受体细胞后便不能进行自主复制；b.切点所处位置必须在载体本身需要的基因片段之外，以避免载体因目的基因的插入而失活。第二节 基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取1.目的基因：编码蛋白质的基因2.获取目的基因的方法：（1）从基因文
6、库中获取基因文库包括：基因组文库（包含一种生物所有的基因）和部分基因文库（只包含一种生物的一部分基因，如cDNA文库）。（2） 利用PCR技术扩增目的基因（3） 人工合成：（条件：基因比较小，核苷酸序列又已知的情况下）反转录法：目的基因的mRNA单链DNA双链DNA（即目的基因）化学合成法：已知蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列目的基因的核苷酸序列目的基因注解：（1）用DNA探针从基因文库中准确提取目的基因由于DNA双链的核苷酸序列是彼此互补的，当DNA分子杂交时，首先使双链解开，根据目的基因的核苷酸序列制成一段与之互补的核苷酸短链，并用同位素标记，以此作为探针，用探针探查基因文库中已经变
7、性的DNA片段，如果有一个DNA片段能和探针互补，结合成双链，这一片段即含有目的基因。（2）详解PCR技术原理：利用DNA双链复制的原理，在体外将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数形式扩增（约为2n，n为扩增循环的次数）.过程：可采用PCR扩增仪，进行扩增（教材）PCR的反应条件：条件作用在一定的缓冲液进行提供相对稳定的pH环境四种脱氧核苷酸作为合成DNA子链的原料DNA母链作为DNA复制的模板TaqDNA聚合酶催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸温度控制90-95变性：使双链DNA解聚为单链55-60复性（退火）：两种引物通过碱基互补配对与两条单
8、链DNA结合70-75延伸：四种脱氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链比较PCR技术和DNA复制PCR技术DNA复制相同点原理碱基互补配对原料四种脱氧核苷酸条件均需要模板（脱氧核苷酸链作为模板）、引物、酶、ATP等不同点场所生物体外细胞内（主要在细胞核内）解旋方式DNA在高温下变性解旋DNA解旋酶催化DNA解旋酶耐热的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶温度条件需控制温度，在较高温度下进行细胞内的温和条件结果短时间内可形成大量的DNA片段形成完整的DNA分子二、基因表达载体的构建1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并
9、且可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。2.组成:（1）启动子：一段特殊结构的DNA片段，位于目的基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。（2）目的基因：编码相关蛋白质，形成基因工程产品或产生新的生物性状。（3）终止子：一段有特殊结构的DNA短片段，位于目的基因尾端，能使转录过程停止。（4）标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。注解：（1） 终止子是指DNA分子上决定转录停止的三个相邻碱基；终止密码子是指mRNA分子上决定翻译停止的三个相邻碱基。（2） 对构建基因表达载体的说明形成重组DNA分子的过程中，必须用同一种限
10、制酶切割目的基因和载体；目的基因插入载体或者插入受体细胞的染色体DNA中并不能说明基因工程操作成功，还要使目的基因在受体细胞中稳定存在和表达，并且可以遗传给下一代；目的基因能在受体细胞中表达，产生相应性状的原因是不同生物共用一套遗传密码；组成基因表达载体的四部分相互协作，缺一不可，共同维持目的基因的表达；基因表达载体虽然都由四部分组成，但由于受体细胞（动物、植物、微生物）不同，基因表达载体的构建也会有差别。（3） 基因表达载体应具备的条件对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动；能自我复制，通过复制进行基因扩增，否则可能会使重组DNA丢失；具有标记基因，以便于鉴定目的基因是否进入受体细胞；
11、重组DNA分子大小应适宜，以方便操作。三、将目的基因导入受体细胞1.操作目的：使目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞内维持稳定和表达，即转化受体细胞。（转化的实质是使目的基因整合到受体细胞染色体基因组中）2.转化方法：受体细胞种类方法特点植物细胞（常用）农杆菌转化法：将目的基因插入到农杆菌的Ti质粒的TDNA上转入农杆菌用农杆菌侵染植物细胞将目的基因整合到植物细胞染色体的DNA上植物产生新性状或蛋白质产物经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物，尤其适用于双子叶植物基因枪法成本较高，常用于单子叶植物花粉管通道法简便、经济，我国科学家独创动物细胞显微注射法：将含有目的基因的表达载体提纯取卵（受精卵
12、）显微注射受精卵经胚胎早期培养后移植到雌性动物输卵管或子宫内发育获得具有新性状的动物最为有效的将目的基因导入动物细胞的方法微生物细胞Ca2+处理受体细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子简便、经济、有效/-注解：不同种类的受体细胞（1） 对于植物来说，受体细胞可以是受精卵和体细胞；（2） 对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，受精卵作为受体细胞具有体积大、易操作、经培养可直接表达性状的优点；（3）微生物细胞作为受体细胞具有繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少等优点。四、目的基因的检测与鉴定1.操作目的：检测和鉴定目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性
13、；2.目的基因的检测与鉴定类型步骤检测内容方法结果显示分子水平检测导入检测（复制检测）目的基因是否插入受体细胞染色体的DNA上DNA分子杂交技术是否成功显示杂交带表达检测转录检测目的基因是否转录出mRNA分子杂交技术翻译检测目的基因是否翻译出蛋白质抗原抗体杂交技术个体水平鉴定是否具有抗性及抗性程度；基因工程产品与天然产品的活性是否相同对转基因生物进行抗虫或抗病的接种实验；比较基因工程产品与天然产品的活性是否赋予了预期抗性或蛋白质活性注解：对基因工程基本操作程序的再理解（1） 在整个操作程序中，除第三步“将目的基因导入受体细胞”外，其他三个步骤均涉及碱基互补配对。（2） 插入的目的基因只是结构基
14、因，其表达还需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入部位前须有启动子，后须有终止子。（3）整个操作程序中使用的工具酶只有两种：限制酶在操作程序1、2中用到且要求是同一种，目的是产生相同的黏性末端，便于连接；DNA连接酶只在操作程序2中用到。第三节 基因工程的应用一、植物基因工程硕果累累1.抗虫转基因植物（1）杀虫基因种类：Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等；（2）成果：抗虫植物2.抗病转基因植物（1）植物的病原微生物：病毒、真菌和细菌等（2）抗病基因种类抗病毒基因：病毒外壳蛋白基因、病毒的复制酶基因等；抗真菌基因：几丁质酶基因、抗毒素合成基因等；（3） 成果：抗烟草花叶病毒的转基因烟草和抗病毒的转基因小麦、甜椒、番茄等；3. 抗逆转基因植物（1） 抗逆基因：调节细胞渗透压的基因使作物抗盐碱、抗旱等；（2） 成果：抗盐碱、抗旱的烟草；4. 利用转基因改良植物品质（1） 优良基因：必需氨基酸的蛋白质编码基因、控制番茄果实成熟的基因；（2）成果：富含赖氨酸的转基因玉米二、动物基因工程前景广阔1.用于提高动物生长速度2.用于改善畜产品的品质3.用转基因动物生产药物（1）建立动物乳腺生物反应器将“药用蛋白
