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1、真菌的常规检验法实验室检查： 标本采集分离培养 直接镜检生化反应 染色镜检免疫学试验一、临床标本的采集 1皮肤的角质性物质：毛发、指（趾）甲、头屑、皮屑 等。2各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、 粪便、尿液等。 3血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴 穿刺液等。4脓汁及渗出物。二、检验方法（一）标本直接检查法不染色标本检查不染色法KOH?i；取病发、皮屑、甲屑载玻片I:,加 1d10%20%KOH,盖上盖玻片并微M热，使标本透凹 镜FU见砲子、菌丝形态染色法：常用革兰染色、乳酸酚棉蓝、捲汁、黄光染色等染色标本检查（二）培养检查（三）鉴定 KOH溶液:本液适于检查致密的难以透明
2、的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）。 墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等） 水合氯醛一石炭酸一乳酸封固液：此液透明力较强，只限于不透明的标本。 生理盐水：为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。微生物学检查步骤： 取患部标本（毛发、皮屑等）置载玻片加10%NaOH （或10%KOH） f微加温消化f镜检（观察菌丝和抱子） 直接镜检的意义 有诊断意义，如浅部真菌病等； 通过真菌的形态，可确定某些致病性真菌的属或种, 如假丝酵母菌的厚膜孢子等； 判断某些真菌种的致病性等，如皮肤癣菌、曲霉等。直接镜检的局限性： 阴性结果不能排除真菌感染； 有假阳性结果。 因此，对直接镜检可疑结果应
3、作复查或用其他检验方法鉴定。2. 染色标本检查（1）革兰染色：各种真菌均染成革兰阳性。2）乳酸酚棉蓝染色 （3）糖原染色： 又称过碘Schiff （简称PAS或PASH）。真菌细胞壁由纤维素和几丁质组成，含有多糖。过碘酸使糖氧化成醛，再与品红亚硫酸结合，成为红色，故菌体均染 成红色。为真菌染色最常用的方法之一。 （4）嗜银染色（GMS）：染成黑色 （5）粘蛋白卡红染色法（MCS）：主要用于新生隐球菌荚膜的染色。隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑 色。 （6）荧光染色： 主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。二）培养检查法 本法可确定菌种，辅助直接检查的不足。 菌落性质：酵
4、母菌还是霉菌； 菌落大小：致病性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大； 菌落颜色： 病原性真菌颜色淡， 污染真菌颜色深； 致病性真菌菌落下沉，有时使培养基开裂；污染性真菌 菌落不下沉，很少引起开裂。标本培养观察标本f沙保培养基f观察菌落形态、假菌丝标本f玉米粉琼脂培养基f观察厚垣抱子2、培养方法接种工具为接种针、接种钩、接种环、接种铲（刀） （1）试管培养:多用于菌种传代接种与保存。 （2）大培养:用平皿或培养瓶培养。 （3）小培养 可观察结构特征及发育的全过程。 1）玻片小培养法 2）郭可大钢圈小培养法： 材料：培养基、钢环（用铁环或废电线的铝丝制成）载玻片、盖玻片、毛细管、石蜡等。钢圈小培养
5、法 先将无菌钢圈以热石蜡固定在玻片和盖玻片之间，钢环开 口处深入底部加入培养基。加够半环即可凝固。用接种针 取少量材料，接种在培养基表面。将接种好的玻片，放在平皿内，并放湿纱布以防干燥。 逐日镜检，一般约7 d即可长好。根据菌丝和抱子的结构特 点进行真菌类别的鉴定。 真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。培养真菌的温度为 28C，但深部真菌为37C。菌落形态是鉴别真菌的判断依 据。动物实验 目的是分离病原性真菌、确定真菌菌种的致病性、研究药 物对真菌的作用等。如假丝酵母菌接种家兔或小白鼠，肾脏明显肿胀，肾皮 质部位有白色脓疡。（三）真菌的鉴定1. 真菌的生化反应用于主要深部感染真菌如假丝酵母菌、隐
6、球菌等。1）糖（醇）类发酵试验37C，观察糖发酵情况。2）同化碳源试验 含菌生理盐水与已融化的固体同化碳源 培养基（45C）混合，然后在培养基上分别加糖，置25C孵 育观察结果。若24h后无变化可重复加糖。如能同化则在 糖周围有生长圈，否则无生长圈。一般对双糖发酵的真菌 能同化或利用糖类或碳源。主要用于酵母菌的鉴定。3）同化氮源试验 同化碳源试验相同，但 需用无氮源 的培养基，不要加糖类，而加入硝酸钾。用于观察酵母菌 对硝酸钾的利用情况。4）明胶液化试验：某些真菌可液化明胶。5）尿素分解试验石膏样癣菌、新生隐球菌等可分解尿素。6）测定淀粉样化合物：某些真菌可产生淀粉样化合物，遇 碘后变成兰色7
7、）牛乳分解试验；真菌可使牛乳酸化、凝固、胨化、碱化 等2、芽管试验取少许待检的白色念珠菌接种于05mL人或兔血清中，混 匀，直37C水浴2-3h后，取出一接种环菌液，涂片、镜检。 有芽管产生者为白色念珠菌，其他念珠菌不产生芽管。3、厚垣孢子形成试验本试验亦是鉴定白色念珠菌的重要方法之一，在玉米粉 聚山梨酯-80琼脂培养基培养本菌，镜检观察到厚垣孢 子及假菌丝。4、核酸检测G+C mol%分类鉴定法常用热变性温度法。原理是DNA加热变性使碱基氢键被打开，双链螺旋变成单 链，导致核苷酸碱基在260nm紫外吸收明显增加，完全变 成单链后，紫外吸收增加停止。紫外吸收增加的中点值温 度为热变性温度(Tm
8、)。真菌DNA中G+C碱基对含量多，Tm值就高。可直接反映G+C碱基对的绝对含量。计算公式为：G+C mol%=(Tm-53.9)X2.44真菌核型的脉冲电泳分析 原理：PFGE有两个方向的电场在设定的脉冲时间里交替变 换，使大分子 DNA 在移动中不断改变自己的形状及迁移方向，从而绕 过细小的凝胶孔隙而得以分离。较大的 DNA 分子泳动慢些，较小的快些 有许多因素影响电泳带型，分离真菌等大分子量的 DNA 宜用较低电压和 较长脉冲时间。用 PFGE 分析真菌核型，可直接比较其遗传背景,从电泳核 型差异中进行 分类鉴定,又能取得基因结构的基本数据，构建出大尺度物 理图谱。1=1RAPD 分析是
9、一种利用随机合成的单个寡核苷酸引物，通过PCR 扩增靶细胞DNA，扩增产物凝胶电泳，分析DNA片段大小和数量的多态 性，从而比较靶基因差异的一种技术。由于病原性真菌基因组庞大，RAPD分析适用于真菌的鉴定与分类。5、免疫学试验用于检测深部感染真菌的抗体，作为辅助诊断组织胞浆 菌、念珠菌、曲霉菌。检测深部感染真菌的抗原，用于早期、快速、特异的诊 断。乳胶凝集法检测新型隐球菌病患者的荚膜多糖抗原 ELISA法检测白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原免疫荧光法检测抱子丝菌病患者的可溶性抗原 放射免疫法检测组织胞浆菌的循环多糖抗原 6、荧光检查 本法主要用于头癣检查。病发在滤过紫外灯照射下可发出 不同色泽的
10、荧光，如黄癣菌病发呈暗绿色荧光，白癣小孢子菌属的病发呈亮绿色荧光等。微生物检验方法1直接镜检：常用墨汁涂片法。2分离培养：在沙保培养基上，室温、37C 23天即可长出典型酵母型菌落。有荚膜者菌落粘稠。有肥厚的荚膜，折光性强，一般染料不易着色，难以发现，称隐球菌在沙保氏琼脂及血琼脂培养基上，于25及37C皆可生长， 而非病原性隐球菌在37C不能繁殖。3糖同化及发酵试验：本菌不发酵各种糖类，但能同化葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖、肌醇，不同化乳糖。4酚氧化酶试验：在含L-多巴橘橼酸铁和咖啡酸培养基中，经2-5天培养，新型隐球菌出现棕黑色菌落。5尿素酶试验：新型隐球菌产生尿素酶，在尿素培养基（含尿素及
11、酚红指示剂）中分解尿素形成氨和CO2,以致培养基的pH值升高，使酚红由黄变为粉红色为阳性，而白色念珠菌为阴性。三、真菌感染的防治原则1、对于皮肤癣菌的感染，应注意个人卫生并辅以抗真菌药物治疗；（达克宁霜剂、癣药水等）2、对于深部感染真菌，去除各种诱发因素，应以提高机体 免疫力为主并辅以抗真菌药物治疗；3、治疗抗真菌药物主要有：两性霉素B、制霉菌素、咪康唑、酮康唑、灰黄霉素、克霉唑等，但应注意这些药物的毒副作用。四、真菌毒素的检测真菌产生有毒的代谢产物，可引起急慢性真菌中毒症，引 起消化道中毒症状，而且可进入人体内引起病变，如引起 肝脏损伤的黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素；引起肾脏损害的 桔青霉素；引起中枢神经系统损害的黄绿青霉素等。甚至有的毒素具有致癌性，如黄曲霉毒素与肝癌发生有关。 检测真菌毒素有许多方法，如检测黄曲霉毒素有生物学方 法和 ELISA 法等。生物学方法主要用于检测真菌毒素的毒性，如用鸡胚、 小白鼠作毒性试验，观察动物中毒死亡或出现肿瘤。 ELISA 法操作简便，并具有安全快速高效、费用低，适 用于大批量标本的筛选。
