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1、实验一薄层层析板的制备一、实验目的制备薄层层析板，使叶绿素在层析板上分离显色。二、实验原理薄层层析，常用TLC（Chromatography）表示，又称薄层色谱，属于液一 固吸附色谱。是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱 色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至0.01 u g ） 的分离；另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可 分离多达500mg的样品。因此又可用来精制样品。故此法特别适用于挥发性较 小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物资。薄层吸附色谱的吸附剂最常用的是氧化铝、硅胶、硅藻土、聚酰胺和纤维素。 其颗粒
2、大小，一般要求直径为1040um。硅胶是无定形多孔性物质，略具酸性， 适用于酸性物质的分离和分析。薄层色谱用的硅胶分为：“硅胶H ”一不含粘 合剂；“硅胶G ” 一含煅石膏粘合剂；“硅胶HF 254 ” 一含荧光物质，可用 于波长为254nm紫外光下观察荧光；“硅胶GF 254 ” 一既含煅石膏又含荧光 剂等类型。粘合剂除上述的煅石膏（半水合硫酸钙：2CaS0 HO ）外，还42可用淀粉、羧甲基纤维素钠。三、实验材料、器具1、试剂 硅胶、4%。的CMC溶液（羧甲基纤维素钠）2、实验用具：药匙、研钵、载玻片、量筒、玻棒四、实验步骤1、载玻片要求平滑清洁，没有划痕，在使用前可用洗涤液或肥皂水洗涤，
3、再用 水冲洗干净。（干净的标准：水不是呈股流下，而是呈瀑布状态流下。）2、与硅胶混合：CMC-Na溶液与硅胶的比例为3:1（3ml： 1g）。取CMCNa溶 液倒入研钵中，然后加入硅胶，在研钵中研磨，按一个方向研磨，自下而上，然 后自上而下，以赶尽气泡为佳。3、铺板：将载玻片置于平台上，用药匙舀取糊状硅胶，均匀地铺在载玻片表面。 铺板时，可以顺着板中间倒，也可以顺着某个边缘倒，也可以用玻璃棒引着溶液 平铺在玻璃板上，倒时也要注意不要引入小气泡。尤其是载板的四个角，容易高 出玻璃板其他部位，所以要格外注意。后轻颠几下薄层板即可。颠好的板，表面 看上去要光滑平整，没有气孔。薄层板铺好后一定要放置在
4、平的台面上，否则难 保证板面硅胶的厚度均匀。（3g硅胶大约可铺7.5X2.5cm载玻片5-6块）4、晾干：置水平台上于室温下晾干。5、活化：将晾干的板子在105C烘箱中干燥30min，然后取出，放入干燥器中， 备用。活化硅胶有利于提高硅胶的吸附性能，同时排除硅胶内部已吸收的水分及 其他气体。通过活化硅胶，主要改变了硅胶内部的微孔结构，使其孔径的大小及微孔结构的排列得到进 离困难。步的改善。但是这样硅胶的吸附变大，可能会使样品分下面先介绍一下配置方法：1. CMCNa溶液的配置：一般其浓度为0.30.5%，根据自己经验而定（我习惯用0.4% 的）。具体方法如下：先将预用的水加热至6070C，然后
5、加入CMCNa，边加边搅拌， 使之溶解，即得。2. 与硅胶混合：CMCNa溶液与硅胶的比例为3： 1。具体方法如下：先将CMCNa溶 液倒入自动或研钵中，然后加入硅胶，搅匀即可。若是在研钵中研磨，按一个方向研磨，自 下而上，然后自上而下，以赶尽气泡为佳。3. 铺板：手动或机械。手动铺出的板的薄厚与所加的混合后的硅胶量有关，而机械铺出的 板的薄厚与机械所选用的钢板有关，可根据需要来定。但此过程中最关键的是板子边缘铺得 好坏，手动铺板一定要将玻璃板边缘硅胶涂匀（我习惯用两头掂法，即板下方的中间垫一物 体，两头悬空，两手均匀掂动）。而机械铺板要注意板与板之间平整性，或者由高到低排列。4. 晾干：自然
6、晾干。5. 活化：将晾干的板子在105C烘箱中干燥30min,取出，放入干燥器中，备用。这是实验室和检验室薄层层析板常用的制备方法之一，供大家参考！层析 英文名称：chromatography定义1：基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离 的技术。当流动相（液体或气体）流经固定相（多孔的固体或覆盖在固体支持物上 的液体）时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。能用于微量样品的分析和 大量样品的纯化制备。定义2：利用某种类型的固定介质，根据混合物分子的电荷大小和分子量不同等 性质，在流动相和固定相之间进行分离的一种生物化学技术。层析（chroma tography ）是“
7、色层分析的简称。利用各组分物理性质的不同， 将多组分进行分离及测定的方法。有吸附层析、分配层析两种。一般用于有机化 合物、金属离子、氨基酸等的分析。层析利用物质在固定相与之间不同的分配比 例，达到分离目的的技术。层析对生物大分子如蛋白质和核酸等复杂的有机物的 混合物的分离分析有极高的分辨力在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为，把液体（与上述液 体不相混合的）或气体作为移动相的系统中，使试料中的各成分边保持向 两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移 动速度差，将它们彼此分离开的定性与，称为层析，亦称。根据移动相种 类的不同，分为液体层析、气体层析二种。用作固定
8、相的有、氧化铝、 树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附 着适当的液体，也可使用其他物质。将作为固定相的微细粉末状物质装入 细长形圆筒中进行的层析称为（column chroma togra-phy ），在玻璃板上 涂上一层薄而均的物质作为固定相的称为薄层层析（thin-layer chroma to graphy ），后者可与用作为固定相的进行同样的分析，即在固定相的一端， 点上微量试料，在密闭容器中，使移动相（液体）从此端渗入，移动接近 另一端。通过这种展开操作，各成分呈斑点状移动到各自的位置上，再根 据Rf值的测定进行鉴定。当斑点不易为肉眼观察时，可利用适当的显
9、色剂, 或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。也可采用在第一种移动相展开 后再用另一移动相进行展开（这时的展开方向应与原方向垂直），使各成 分分离完全的双相层析（two-dimensional chroma to graphy ）。分离后, 将斑点位置的固定相切取下来，把其中含有来自试料的物质提取进行定量 分析。但为制备与定量，柱层析则更为适宜。在柱层析中，移动相从加入 试料的一端展开到达另一端后，继续展开使各成分和移动相一起向柱外分 别溶出，这就是广泛使用的所谓洗提层析（elu tion chroma tography ）。 层析根据固定相与（试料）间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交
10、换型（离子交换层析）等三种类型。但这并不是很严格的，有时常见到其 中间类型。此外，近来也应用亲和层析，即将与基质类似的（通常为共价 键）结合到固定相上，再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或 蛋白质。按层析的机理划分：吸附层析、分配层析、离子交换层析、层析等。吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴 定的目的。分配层析：利用不同组分在和固定相之间的分配系数不同，使之分离。 离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。:利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。按流动相与固定相的不同划分：气相层析、。这两大类层析是以流动相不同来划分的。如同时区分流 动相
11、和固定相，划分为：、气液层析、和液液层析等。按操作形式划分：柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析等。柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。 纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离 鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行 物质的分离和鉴定。以上划分无严格界限，有些名称相互交叉，如亲和层析应属于一种特 殊的吸附层析，纸层析是一种分配层析，柱层析可做各种层析。基本原理层析须在两相系统间进行。一相是固定相，需支持物，是固体或液体。另 一相为流动相，是液体或气体。当流动相流经固定相时，被分离物质在两 相间的分配，由平衡状态到失
12、去平衡到又恢复平衡，即不断经历吸附和解 吸的过程。随着流动相不断向前流动，被分离物质间出现向前移动的速率 差异，由开始的单一区带逐渐分离出许多区带，这个过程叫展层。系数K是物质在两相中的浓度比。K值大，则在固定相中吸附牢，K值 小吸附差。各物质间的K值差别大，则易被分离。不同类型层析的 K值含 义不同，可视为吸附平衡常数，分配常数或离子交换常数等。研究层析现象而发展的，与有机化学实验中的分馏法原理有些相似。 被分馏的有机在分馏柱内的填充物上形成许多热交换层，从而把低沸点溶 剂先分馏出来，达到纯化的目的。在层析时用理论塔板数 n来衡量层析效 能。tR为物质在上的保留时间，W为洗脱下来的物质峰形的
13、宽度。n值愈大 表示层析柱的效能愈高。如用H表示，则包含了层析柱长度的因子。式中L为层析柱的柱长。H值越大，则柱效越低。此外影响层析分离效果的还有涡流扩散、纵向扩散和传质阻抗等 因素。因此选择层析固定相支持物的粒度、均匀度等物理性能，流动相的 层析系统和温度等都是做好层析的关键几种常用的层析吸附剂的吸附力强弱，是由能否有效地接受或供给，或提供和接受活 泼氢来决定。被吸附物的化学结构如与吸附剂有相似的电子特性，吸附就 更牢固。常用吸附剂的吸附力的强弱顺序为：活性炭、氧化铝、硅胶、氧 化镁、磷酸钙、石膏、纤维素、淀粉和糖等。以活性炭的吸附力最强。 吸附剂在使用前须先用加热脱水等方法活化。大多数吸附
14、剂遇水即钝化， 因此吸附层析大多用于能溶于有机溶剂的有机化合物的分离，较少用于无机化合物。洗脱溶剂的解析能力的强弱顺序是：醋酸、水、甲醇、乙醇、 丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、和己烷等。为了能得到较好的分离效果, 常用两种或数种不同强度的溶剂按一定比例混合，得到合适洗脱能力的溶 剂系统，以获得最佳分离效果。在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是水相和有机溶剂相。常 用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等，这些亲水物质能储留相当量的水。被 分离物质在两相中都能溶解，但分配比率不同，展层时就会形成以不同速 度向前移动的区带。支持物是人工交联的带有能解离基团的有机高分子，如离子交换树脂、 离子交换纤维素、
15、离子交换凝胶等。带阳离子基团的，如磺酸基（一SO3H）、 羧甲基（一CH2COOH ）和磷酸基等为阳离子交换剂。带阴离子基团的，如 DEAE（二乙基胺乙基）和QAE（四级胺乙基）等为阴离子交换剂。离子 交换层析只适用于能在水中解离的化合物，包括有机物和无机物。对于蛋 白质、核酸、氨基酸及核苷酸的分离分析有极好的分辨力。离子交换基团 在中解离后，能吸引水中被分离物的离子，各种物质在离子交换剂上的离 子浓度与周围溶液的离子浓度保持平衡状态，各种离子有不同的交换常数， K值愈高，被吸附愈牢。洗脱时，增加溶液的离子强度，如改变 pH，增加 盐浓度，离子被取代而解吸下来。洗脱过程中，按K值不同，分成不同
16、的区带。凝胶过滤层析支持物是人工合成的交联高聚物，在水中膨胀后成为凝胶。凝胶内为 内水层，凝胶周围的水为外水层。控制交联度以形成不同孔径的网状结构。 交联度小的孔径大，交联度大的孔径小。凝胶只允许被分离物质中小于孔 径的分子进入，大于孔径的分子被排斥在外水层，最先被洗脱下来。而进 入孔径的分子也按分子量大小大致分离成不同的区带。选择不同规格的凝 胶，可把一个混合物按分子量的差异分成不同的组分。这种方法曾被称为 分子筛。目前常用的凝胶商品有：凝胶（sephadex ）、凝胶（bio-gel ）、 凝胶（sepharose ）和凝胶（styragel ）等。在一对有专一的相互作用的物质中，把其中之一联结在支持物上，用 于纯化相对的另一物质。常见的亲和对如：和抑制剂，抗原和抗体，和等
