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1、实时荧光定量PCR ( realtime PCR )一、样品RNA的抽提1. 取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。2. 两相分离 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。 手动剧烈振荡管体15秒后，15到30C孵育2到3分钟。4C下12 000 rpm离心 15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上 层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL 试剂的60%。3. RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇 混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30C孵育10分钟后
2、，于4C下12000 rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉 淀块。4. RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZ0L试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75% 乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4C下7000 rpm 离心5分钟。5. RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10min6. 溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40卩1用枪反复吹打几次， 使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80C待用。二、RNA质量检测1. 紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取
3、少量RNA溶液用TE稀释(1:100) 后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和 纯度。(1) 浓度测定A260下读值为1表示40 pg RNA/ml。样品RNA浓度(yg/m 1)计算公式为：A260 x 稀释倍数x 40 pg/mlo具体计算如下：RNA 溶于 40 pl DEPC 水中，取 5 pl, 1:100 稀释至 495p1 的 TE 中，测得 A260 = 0.21RNA 浓度=0.21 xl00 x40 pg/ml = 840 pg/ml 或 0.84 pg/pl取5 ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 pl,剩余RNA总量为：35
4、pl x 0.84 pg/pl = 29.4 pg(2) 纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。2. 变性琼脂糖凝胶电泳测定(1)制胶1 g琼脂糖溶于72 ml水中，冷却至60C, 10 ml的10x MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37%甲醛溶液(12.3 M)。10XMOPS电泳缓冲液浓度成分0.4 M MOPS，pH 7.00.1 M乙酸钠0.01 M EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 m溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板 放入电泳槽内，加足量的1XMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。(2)准备RNA样品 取3 pgRNA,加3
5、倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为 10卩g/ml。加热至70C孵育15分钟使样品变性。(3) 电泳上样前凝胶须预电泳5 min，随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h，电 泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。(4) 紫外透射光下观察并拍照 28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类 型)，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍 微扩散的带，它由低分子量的RNA (tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和 28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异 型RNA组成。R
6、NA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA 带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖 体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。三、样品cDNA合成1. 反应体系序号反应物剂量12345678逆转录buffer上游引物下游引物dNTP逆转录酶MMLVDEPC 水RNA模版总体积2 pl0.2 pl0.2 pl0.1 pl0.5 pl5 pl2 pl10 pl轻弹管底将溶液混合,6 000 rpm短暂离心。2. 混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70C干浴3分钟，取出后立即冰水浴 至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5 pl，37C水浴60分钟。3
7、. 取出后立即95C干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液,保存于-80C 待用。四、梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（lactin）实时定量PCR1. 卩-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011,反应前取3卩1按 10倍稀释（加水27卩1并充分混匀）为1010,依次稀释至109、108、107、106、 105、104，以备用。2. 反应体系如下：标准品反应体系序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10卩12阳性模板上游引物F0.5 卩13阳性模板下游引物R0.5 卩14dNTP0.5 卩15Taq酶1卩16阳性模板DNA5卩17ddH2O32.5 卩18
8、总体积50卩1轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。3. 管家基因反应体系：序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10卩12内参照上游引物F0.5 卩13内参照下游引物R0.5 卩14dNTP0.5 卩15Taq酶1卩16待测样品cDNA5卩17ddH2O32.5 卩18总体积50卩1轻弹管底将溶液混合，6000 rpm短暂离心。3. 制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93C 2分钟，然 后93C 1分钟，55C 2分钟，共40个循环。五、制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板1. 针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反 应。
9、2. 反应体系序号反应物剂量110x PCR缓冲液2.5 ul2MgC12溶液1.5 ul3上游引物F0.5 ul4下游引物R0.5 ul5dNTP混合液3 ul6Taq聚合酶1 ul7cDNA1 ul8加水至总体积为25 ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR循环(94C1分钟；55C1分钟；72C1分钟)；72?C延伸5分钟。(3) PCR产物与DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR 产物是否为单一特异性扩增条带。(4) 将PCR产物进行10倍梯度稀释：将PCR产物进行10倍梯度稀释：设定 PCR产物浓度为1X1010,依次稀释至109、1
10、08、107、106、105、104几个浓度梯 度。六、待测样品的待测基因实时定量PCR1.所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。2.体系配置如下：序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10 ul2上游引物1 ul3下游引物1 ul4dNTP1 ul5Taq聚合酶2 ul6待测样品cDNA5 ul7ddH2O30 ul8总体积50 ul轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。(3)将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反 应条件为：93C 2分钟预变性，然后按93C 1分钟，55C1分钟，72C1分钟， 共40做个循环，最后72C7分钟延伸。七、实时定量PCR使用引物列表引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互 补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的 位点引发DNA聚合反应(即错配)。八、电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异 性扩增条带。
