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1、第八章 工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化分子生物学的发展使蛋白质的表达和生产进入到一个新的时代。大肠杆菌由于遗传背景清晰，容易培养，可以大规模发酵，以及大量可供选择利用的克隆和高效表达载体而成为目前人们克隆和表达外源基因的首选菌株。但是，在实际操作中重组蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达往往导致蛋白质聚集形成不溶性的包涵体。包涵体的形成虽有不少优点，如可溶性形式存在的外源蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，而包涵体形式存在的外源蛋白则不易被蛋白酶降解；包涵体的形成降低了细胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高；包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化；包
2、涵体对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离等。但是，无活性的包涵体蛋白质需经过复性使其折叠成为具有天然构象和生物活性的蛋白质，这通常是一件很困难的事情，而且不同的蛋白质其复性方法也各不相同，因此基因重组蛋白质的复性一直是生物工程下游纯化技术的研究热点之一。现有的生物技术研究和产业化过程表明，重组蛋白包涵体的变性及复性是重组蛋白类药物生产中最为关键的技术之一，是基因工程产品商业化的瓶颈，也是一个世界性难题。第一节 包涵体形成的原因 什么是包涵体 所谓包涵体是指由于表达部位低电势及外源蛋白质分子的特殊结构（如Cys含量高），如低电荷，无糖基化等，使得重组蛋白质与核酸，周围杂蛋白质
3、（如核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白质ompC、ompF和ompA等），以及脂体、脂多糖等形成的聚合体(图8-1)。包涵体一般大小为0.13.0 m，具有很高的密度（约1.3 mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于尿素、盐酸胍等变性剂。包涵体中重组蛋白质一般占包涵体总成分的50%以上，它们没有生物学活性，因为蛋白质分子没有形成正确的构象。有报道表明成熟的分子相比包涵体内蛋白质含有更多的结构而较少的a结构，也有报道表明包涵体中的肽链已获得与天然蛋白质分子非常接近的空间构象。图8-1 在大肠杆菌中表达的包涵体（来源于Dr. Hauke LiLie)形成包涵体的原因包涵体形成的原因是多方
4、面的，归纳起来大致有以下几方面：（1）基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平：研究发现在蛋白质低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是蛋白质合成的速度太快，多肽链相互缠绕，缺乏使多肽链正确折叠的因素，二硫键不能正确的配对，疏水基团外露等。一般当表达的目的蛋白质量超过细菌总蛋白质量的10%时，就很容易形成包涵体。（2）重组蛋白质的氨基酸组成：一般而言含硫的氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量也明显与包涵体的形成呈正相关。（3） 宿主菌及其培养条件：较高的发酵温度容易导致包涵体的形成，而降低宿主菌的培养温度被证明对增加重组蛋白的可溶性表达是有效的。主要原因可能
5、是降低温度可以增加折叠中间体的稳定性或减少折叠中间体之间错误的相互作用，特别是疏水作用。丰富的培养基被认为有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，也容易导致包涵体的形成。此外选择合适的宿主菌，改变培养基的pH等方法有时也能增加重组蛋白质的可溶性表达。（4）重组蛋白质缺乏翻译后修饰：由于大肠杆菌表达系统属于原核表达系统，缺少真核细胞中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，故致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。（5）蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键。这其实与蛋白质本身的性质有关，如果蛋白质合成后，其本身的溶解度比较高
6、，就不容易形成包涵体。（6）在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。第二节 包涵体的制备和溶解 基因工程发酵液经离心浓缩后，可用机械磨碎法、超声波处理法或溶菌酶加去污剂的方法使细菌裂解，裂菌程度可通过取样镜检来确定。裂菌完成后离心收集沉淀即为包涵体，离心分离包涵体时的离心力不宜过大，离心时间不宜过长，以电泳检测上清中基本不含重组蛋白质即可，这样可以减少沉淀中菌体细胞膜碎片、核糖体等的含量从而提高粗制包涵体的纯度。包涵体分离方法的选择与所表达蛋白质的性质没有明显关系。为了去除粗制包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，可应用洗涤液洗涤包涵体。洗涤液通常
7、选用去污剂Triton X-100、脱氧胆酸钠、蔗糖、尿素、盐酸胍等配制。但必须注意过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解。经洗涤后的包涵体的纯度一般可达到80%左右。洗涤、纯化后的包涵体必须用含变性剂的溶液使之溶解。溶解的过程一般应包括包涵体蛋白质的变性和错配二硫键的还原。包涵体蛋白质变性常用的变性剂有47mol/L的盐酸胍，68 mol/L的尿素，以及一些去污剂如1%2%的SDS、脱氧胆酸盐等。有时不用变性剂而采用pH2.04.5的酸性溶液也可以使包涵体溶解。在使用变性剂溶解包涵体时最通常选用的是盐酸胍，这主要有两方面原因：一是因为盐酸胍是一种相对更强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解
8、；二是由于尿素分解的异氰酸盐会导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是长时间处于碱性环境下时如此，而使用盐酸胍则可以避免这一问题的产生。例如用盐酸胍溶解人IL-4包涵体可以提高它的复性率，而用尿素溶解则得不到有活性的蛋白质。如果蛋白质含有半胱氨酸，则包涵体中可能含有分子内和分子间二硫键，这时应添加还原剂如二硫苏糖醇（DTT）、还原性谷胱甘肽（GSH）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、胱胺、b-巯基乙醇（b-MT）等使二硫键通过硫醇-二硫化物交换而还原。常用的是DTT和b-MT。DTT的还原能力比-MT强，因此DTT的用量一般比b-MT少。但Fischer等比较了多种溶解包涵体的实验方案后认为，包涵体的溶解、
9、还原方法与它的天然构象中含有的二硫键的数目之间没有明显关系。对于有些没有二硫键的蛋白质加不加还原剂都不影响包涵体的溶解；但是对于另一些没有二硫键的蛋白质，还原剂的使用常常可以增加其溶解性，这可能是由于含有二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。实验方法举例。1 材料和仪器：（1）TE1缓冲液：Tris-HCl 50 mmol/L pH8.0， EDTA 1 mmol/L， NaCl 100 mmol/L（2）TE2缓冲液： 0.5% Triton X-100（V/V），Tris-HCl 20mmol/L，pH 7.0，EDTA 1mmol/L, NaCl 100 mmol/L（3）变性液：盐酸胍6
10、mol/L，Tris-Cl 20 mmol/L pH 7.0，EDTA 1 mmol/L ,NaCl 100 mmol/l（4）低温高速离心机, 超声裂菌仪2操作步骤：（1）称取30 g湿菌置于500 ml烧杯中，加入300 ml TE1缓冲液，加入搅拌子搅拌20 min，使菌体分散均匀。（2）将上述烧杯置于冰浴，用超声破菌仪超声破菌20-40次（30 s/次，间隔30 s），每隔10次取样涂片作革兰氏染色，显微镜下检查，当每个视野内未破菌2个时，超声破菌结束。（3）将超声破菌液转移至500 ml离心管，在低温高速离心机上，7 000 rpm，4离心20 min，弃上清。（4）在沉淀中加入30
11、0 ml TE2缓冲液，加入搅拌子搅拌30 min。取出搅拌子，将装有悬浊液的离心管在低温高速离心机上，7 000 rpm，4离心20 min，弃上清。（5）在沉淀中加入150 ml变性液，加入搅拌子搅拌溶解2 h。取出搅拌子，将装有悬浊液的离心管在低温高速离心机上，8 000 rpm，4离心30 min，将上清转移至一个500 ml烧杯中。所得上清即为变性的蛋白液。不同包涵体的大小和密度并不相同，因而离心分离的时间和转速应通过实验确定。以分离的上清经蛋白质电泳基本不含目的蛋白质即可，不宜使用过高的转速和过长的时间，以使一些细胞膜碎片留在上清中，从而提高包涵体的纯度。对包涵体的洗涤方法是可选的
12、，且Triton X-100和盐酸胍的浓度也应通过实验确定。蛋白质变性剂的种类和浓度也应通过实验确定。第三节 包涵体的复性一、影响包涵体复性的因素 复性的过程主要包括肽链的折叠和分子内二硫键的氧化，这是两个相互影响的过程，适当折叠的肽链常常有利于二硫键的形成，同时，正确的二硫键形成有利于折叠产物的稳定。 变性蛋白质在去除或降低变性剂浓度后，就会自发地由变性时的热力学不稳定状态向热力学稳定状态转变。这一过程是一个复杂的过程，主要包括变性剂去除或降低后，变性蛋白质从伸展态迅速卷曲形成第一中间态，也称融球态（molten globues，MG)的形式。在这种状态下，蛋白质的疏水基团处于蛋白质的表面。
13、然后融球态蛋白质的疏水基团向蛋白质内部折叠成疏水核心，即转变为第二中间态，并进一步折叠为天然态，这一过程相对缓慢。融球态由于其表面的疏水分子在分子间碰撞中容易发生分子间可逆的暂时缔合，形成二聚体，二聚体进一步缔合就会形成多聚体，最终形成沉淀。因而这一步是影响一些蛋白质复性回收率的限速步骤。 除此之外，影响蛋白质复性的因素还有很多，如蛋白质浓度、变性剂浓度、复性的方法等，下面举例说明。（一） 蛋白质浓度 复性过程中正确折叠的蛋白质往往得率很低，这通常是由于多肽链的聚集作用引起的。蛋白质浓度是促使蛋白质聚集的主要因素。聚集反应是一个分子间反应，它至少涉及两条肽链。它的速度与蛋白质浓度的n（n2）次
14、方成正比。折叠中间体在高浓度下产生聚集的主要原因之一是由于暴露在它们表面的疏水基团的相互作用，而折叠过程与蛋白质的浓度无关。因此为了减慢聚集反应，蛋白质的浓度一般应控制在10-100 mg/L。分子缔合与MG向第二中间态转变不同，后者主要是一级反应，其速度往往随蛋白质浓度的增加而增加，因而在变性蛋白质复性工作中降低蛋白质浓度往往可以提高复性的效率，但实际上过低的浓度又会给后续纯化工作带来困难，而且在工业生产中通过降低蛋白质的浓度来减慢聚集反应的速度也是不经济的，这需要消耗大量的复性液，同时增加工作量。因而应通过实验来选择合适的蛋白质浓度，目前认为这一浓度通常为10-200 mg/L。（二） 氧
15、化还原条件对于含有二硫键的重组蛋白，在复性时需要考虑为之提供合适的氧化还原条件以使之形成正确的二硫键。常用的方法有以下几种。1空气氧化法 这是直接利用空气中的氧气氧化变性蛋白质使之形成正确二硫键的方法。使用该方法时，合适浓度的金属离子如二价铜离子，锌离子等可以促进空气的氧化作用。但是该方法较难实现对整个过程的精确控制。2 硫化物氧化法 这是利用硫化物提供的氧化还原条件而促使变性蛋白质中半胱氨酸间形成正确二硫键的方法。氧化还原环境可由氧化型谷胱甘肽-还原型谷胱甘肽提供，也可由胱氨酸-半胱氨酸提供。该方法的优点是可以通过控制硫化物的浓度和比例来控制氧化的程度，缺点是比较昂贵。3DTT氧化法 变性蛋
16、白质的半胱氨酸与氧化型DTT反应形成一个不稳定的折叠中间体，该中间体可随着还原型DTT的释放和分子内二硫键的形成而分解，最终实现二硫键的正确形成。利用该方法也可以通过控制氧化型DTT的浓度来实现对氧化程度的控制。4温度和pH 为了防止蛋白质的水解，一般认为复性温度在4最好；另外，蛋白质样品肯定是未经灭菌的，因此较低的温度有利于抑制细菌的生长。同时复性液的pH值必须在7.0以上，这样就可以防止自由硫醇的质子化作用影响二硫键的正确配对和形成，一般而言复性的最佳pH值为8.0-9.0。5无规凝聚抑制剂或协同因子的添加 聚乙二醇（PEG）、甘油、环状糊精，葡萄糖、硫胺、Triton X-100、蔗糖等分子的添加可有效地促进变性蛋白质的正确折叠，它们可通过不同的作用提高复性的效果。如盐酸胍能保护没有折叠或部分折叠分子的疏水
