荧光量子点

《荧光量子点》由会员分享，可在线阅读，更多相关《荧光量子点（18页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、荧光量子点在生物体内分子和细胞成像中的应用原文 Xiaohu Gao, Lily Yang, John A Petros, Fray F Marshall, Jonathan W Simons and Shuming Nie. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current Opinion in Biotechnology 2005,16, 6372.量子点（Quantum Dot）是一类具有纳米尺寸的发光粒子，它作为一类新的 荧光材料被应用于生物分子和细胞成像中。和传统的有机染料分子和荧光蛋白相 比，量子点具

2、有独特的光学和电子性质，如它具有发射光波长可调，高亮度，抗 光漂白性以及多种量子点不同颜色荧光同时激发的优点。目前已经开发出多功能 的纳米微粒荧光探针就具有高亮度和生物体内稳定存在的特点。在量子点的结构 设计上，先在量子点基本结构的外围引入一层两性的共聚物外壳，然后再将这层 外壳与肿瘤特异性识别配体或药物转运官能团相连。带有聚合物外壳的量子点对 细胞和动物是无毒的，但它们对细胞的长期毒性和降解机制还需要深入研究。与 生物组织相连的量子点为动物或是人体高灵敏多元细胞成像技术开辟了道路。简介半导体量子点在过去的 20 年里已经引起了广大科学工作者的兴趣，它表现 出来的奇特的光学和电子性质是单个分子

3、或是大尺寸的固体所没有的。近来，纳 米荧光量子点已经被用来作为荧光探针用于生物机理的研究，与传统的有机染料 和荧光蛋白相比，它具有以下的优点：通过调节量子点的大小和组成可以获得从 红外到可见波长的荧光发射，而且它在比较宽的吸收波长范围内具有大的摩尔消 光系数，它较其他类型的荧光探针具有高亮度和光稳定性的优点1。因为它的宽 吸收波长范围和窄发射波长，各种颜色和发射强度的量子点被用于生物体蛋白、 基因序列和其他生物分子的研究2-4。尽管荧光量子点具有相对大的尺寸（直径2-8nm），但现有的研究表明量子 点荧光探针的行为与荧光蛋白（直径4-6nm ）类似，而且从目前的荧光量子点的 众多应用实例中还没

4、有发现它在成键动力学和立体位阻方面存在问题5-12。这样 一个中等大小的纳米量子点，具有较大的表面积，并且自身带有可以与“诊断试 剂”和“治疗试剂”相连的官能团。此外，到目前为止，还未发现带有高聚物外壳 的量子点对动物细胞有毒性。在本文中，我们将展示一下近两年来荧光量子点的 新发展以及它作为荧光探针在细胞成像中的应用，特别是多功能荧光量子点在活 体肿瘤识别和成像中的应用。读者想要了解更多的有关荧光量子点的报道，请参 考以下几篇文献1, 13, 14。量子点荧光探针的发展量子点荧光探针的发展主要集中在它的合成、溶解性问题以及在生物学中 的应用。这种荧光粒子一般是由成百上千个第二副族和第六主族元素

5、的原子（如 CdSe和CdTe）或是第三副族和第五主族元素的原子（如InP和InAs）构成。目 前已经可以通过控制条件来达到对粒子直径、形状（圆点、棒状或四面体） 15 18和内部结构的调控（母核外壳、梯度合金、单一合金） 19-22。此外也可以合 成二元素体系和三元素体系的荧光量子点。通过调节粒子的大小和母核的化学组 成，可以获得荧光发射波长从400 nm 到2000 nm 的量子点，荧光量子产率在室 温下可以达到 8523。性能优异的荧光量子点可以在有机溶剂中高温下制备，这些有机溶剂往往具 有较高的沸点，并且常带有长的烷基链（如 tri-n-octylphosphine oxide （TO

6、PO）, hexadecylamine 等）。这些憎水的有机溶剂不仅仅是作为反应介质，更主要的是 它们长碳链末端 N 原子或是 O 原子可以与量子点表面未配位饱和的金属原子作 用，防止小粒子聚集形成大固体。结果，在这些量子点母核的表面形成了一单层 的有机溶剂分子保护层，并且憎水性的长碳链向外伸展；这样具有“包裹”粒子基 本结构的量子点只能溶于一些非极性的溶剂（如氯仿）。为了便于荧光量子点在 生物成像中的应用，我们可以在憎水的量子点基本结构的外围引入一层两性的高 聚物的外壳，使得它的水溶性增加；这样的两性高聚物往往由两部分组成，即憎 水的长烷基链和亲水部分（可以是PEG或是多个羧酸官能团）。许多

7、类型的两性 高聚物已经被报道5, 24, 25, 26，如含有正辛胺长链的聚丙稀酸，PEG连接的磷酯、 共聚物、聚酸酐等。如 Figure 1所示,Figure 1多功能量子点荧光探针的结构。这张示意图显示了量子点母核的TOPO保护层，两性高聚物层,恶性肿瘤识别配体（多肽，抗体和）小分子抑制剂，以及PEG连接单元。两性高聚物上的憎水边链与量子点基本结构的 TOPO 发生强烈的憎水基相 互作用，而高聚物上的亲水部分则裸露在外面，使得荧光量子点变成水溶性的。 荧光量子点基本结构中的TOPO仍旧紧紧地包裹在量子点母核的外面，将母核与 外界环境隔离开，使量子点保持良好的荧光性能。为了提高荧光量子点的生

8、物目 标识别能力，通常两性高聚物包裹的量子点与具有生物目标特异识别能力的单克 隆抗体、多肽、寡核苷酸或小分子抑制剂相连。通过 PEG 与其他配体相连可以 提高量子点的生物相容性并减少它的非特异性标记。荧光量子点与生物目标物的连接方式主要有被动吸附、多鳌合配位连接和共 价连接（Figure 2）。两个常见的连接方式是碳酰亚胺-活化酯参与的酰胺键生成 和马来酰亚胺参与的氨基与巯基的连接反应。传统的酰胺键连接方式可以免去底 物本身烦琐的化学修饰，因为大多数的目标蛋白本身都含有一定量的氨基和羧基官能团。氨基和巯基连接方式的不利因素是含有游离的巯基的天然生物分子很 少，而且在氧气存在下巯基也是不稳定的。

9、近来也有基于其他官能团连接策略报 道。Pellegrino等26报道了用包含酸酐官能团的两性高聚物来提高荧光量子点的 水溶性，而量子点外层的酸酐官能团很容易与伯氨在没有缩合剂存在的条件下高 效的反应。因为包含酸酐官能团的高聚物是一类可以生物降解的高分子，所以它 被广泛地应用于药物转运和组织工程研究27,28。(a)TOOOIH009-QuantumdotI 0001-COOHEDACQuantum dotQua ntumdotSH iSH iHSh|HS匚VQuantum dotQua ntum dotAdaptor protein(d)H009-QuantumdotICOOHBinding

10、siteHis6Quantum dotQuantum dotHis-taggedpeptideCurrent Opinion in BiotechnologyFigure 2量子点与生物分子的连接方式：a) edac参与的传统化学共价连接方式；b)通过smcc参与的巯基与氨基还原偶联将抗体与量子点相连；C)通过受体蛋白将抗体与量子点相连；d)含有六组氨酸标签 的多肽和蛋白与Ni-NTA修饰的量子点连接，定量定点。目前，已经有很多的连接策略被发展，使得连接到带有两性高聚物外壳的量 子点的配体分子能够定点地连接并且配体分子的数量可以控制。但是配体分子在 荧光量子点上的精确定位和数量还不能非常理想地

11、调控.Goldman小组29首先报 道了一种连接策略，他们先在量子点上连接上一个融合蛋白，此融合蛋白上带正 电的亮氨酸部分通过静电相互作用与带有负电的荧光量子点连接，然后蛋白上的 免疫球蛋白G部分可以与抗体上的Fc部分相互作用而连接，而抗体上的具有特 异目标识别作用的F(ab)部分就裸露在量子点的外围(Figure 2c)。另外一种方 法是先在量子点的外围连上一个NTA和Ni的鳌合物，然后这样一个Ni上未配 位饱和的量子点可以与包含六组氨酸标签的生物分子通过配位作用连接(Figure 2d)。这种直接的基于六组氨酸标签的连接策略可以使得量子点定点地连接到目 标分子上，紧缩了整个荧光探针的体积，

12、有利于连接效率的提高，而且制备成本 低廉(直接连接，纯化步骤简单)。新颖的光学性质根据前面的简要介绍，荧光量子点可以通过无机半导体材料制备。它的优异 荧光性质大大提高了荧光检测中的信噪比。荧光量子点具有非常大的摩尔消光系 数(0.5-5X106M-1 cm-i) 30,从而使它在照射有限的活体环境中较其他荧光探 针显得更亮(活体环境中由于散射和吸收作用的存在大大削弱了激发光的强度)。 从理论上讲，荧光物质的激发态寿命决定了它的荧光发射速率，由于量子点的激 发态寿命较长(20-50ns),所以它的荧光发射速率约为传统的有机染料的 1/5-1/10。实际上，荧光成像技术通常是在受限激发的条件下操作

13、的，这样的话 荧光发射强度主要取决与荧光物质对激发光的吸收。因为荧光量子点的紫外消光 系数(5-10X104 M-1 cm-1)大约是有机染料的10-50倍，因而导致在同样的激发 条件下它的紫外吸收速率是有机染料的 10-50倍，因此它的荧光发射强度为有机 染料的10-20倍31, 32 (Figure 3a)。此外，荧光量子点的抗光漂白能力也较有机 染料强几千倍，因此它特别适合作为长时间连续跟踪成像的荧光材料( Figure3b）。由于荧光量子点具有较长的激发态寿命，所以通过时间控制的成像技术可以 将量子点发射的荧光很方便地从背景荧光中区别出来33, 34。如Figure 3c所示的 是有机

14、染料和荧光量子点荧光发射强度随时间的衰减曲线，假设荧光量子点和有 机染料同时受到激发，并且假设两者初始的荧光发射强度相同，荧光量子点的激 发态寿命是有机染料的10倍，那么我们就会观测到从0-10ns的极短时间内，两 者的荧光发射强度比IQD/Idye从1增加到100。因此,在这样一个体系中运用时间 延迟数据采集技术，可以使得获得的图像的对比度（信噪比）显著地提高。.64.2 O.O.O. (ne) AUSUZU-100 21020 3QTime (ns)50300400500600700800Wave I ength (nm).8 4.2O0.0.0.0.(nB) Ausuelu-(d)(ne

15、) A 七 su C一 Ou Osalon-LL100120140Excitation350 nmQDs: 520 and 650 nmMouse skinMouse skin + QDsCurrent Opinion in BiotechnologyFigure 3荧光量子点的奇特光学性质。a）三种相同摩尔浓度的荧光物质TRITC ,绿色量子点，红色量 子点在正常光照条件下的荧光现象。因为量子点具有较大的紫外消光系数，它表现出了的荧光较有机染料 强；b）相同光激发条件下，量子点表现出是有机染料几千倍的抗光漂白能力；c）量子点和普通有机染料激 发荧光衰减曲线比较。由于量子点较长的激发态寿命，使

16、得时间控制的成像技术得以运用，并将背景荧光 噪音降至最低。Tdye和tqd是当荧光发射强度下降到原来的1/e的弛豫时间；d）在同一激发光条件下，老鼠 皮肤背景荧光发射图和体内含有量子点的老鼠荧光发射图。（在扣除老鼠本身皮肤背景荧光发射后，可以得 到量子点的荧光发射图）。荧光量子点具有极大的 Stokes 位移，它有利于检测灵敏度的提高。在体内 生物分子成像中，往往会有很强的背景荧光，干扰正常的检测过程，而量子点这 一光学特性可以使它的发射荧光和背景荧光通过基于波长检测技术区别出来。从 Figure3d 可以看到，荧光量子点的 Stokes 位移在不同的激发光下可以达到 300-400 nm,而