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1、实验五 高效液相色谱法测定蛇葡萄属植物黄酮的含量一、目的要求1、了解高效液相色谱法分离测定样品含量的实验原理及测定方法。2、了解高效液相色谱仪的主要组成、操作要点及其维护知识。二、实验原理及相关知识 高效液相色谱法又称高压液相色谱法。是20世纪60年代末，在经典液相色谱（采用普通规格的固定相及流动相常压输送的液相色谱）的基础上，引入气相色谱的理论和实验方法，流动相改为高压输送、采用高效固定相及在线检测手段发展起来的一种分离分析方法。高效液相色谱法与经典液相色谱法相比具有：适用性广，分离性能好，测定灵敏度高，分析速度快，流动性可选择性范围宽，色谱柱可反复使用，分离组分易收集等特点。高效液相色谱仪
2、主要组成 高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器及数据处理系统等组成，其中输液泵、色谱柱及检测器是仪器的关键部件。高效液相色谱类型 高效液相色谱法类型按色谱的分离模式有多种，其中正相色谱、反相色谱、离子交换色谱是常见的几种色谱法。正相色谱流动相的极性小于固定相的极性的液相色谱法；反向色谱流动相的极性大于固定相的极性的液相色谱法；离子交换色谱以离子交换剂为固定相，用缓冲溶液为流动相，靠选择性系数差别而分离的离子交换液相色谱法。 高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液体以提高分离速度，采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。高效液相
3、色谱对流动相的基本要求（1）不与固定相起反应；（2）对样品有适宜的分离度；（3）必须和检测器相适应；（4）黏度要小。组分分离时对流动相的选择：（1）溶剂的极性：正相色谱中，溶剂的极性越大，其洗脱能力就越强；反响色谱中，溶剂的极性越大，其洗脱能力越弱；（2）流动相选择的原则：在正相色谱中，可先选用中等极性的溶剂作为流动相。观察组分保留时间的长短，调整合适的流动相。常采用乙烷、庚烷、异辛烷、苯、二甲苯等有机溶剂作流动相，必要时还加入一定量的四氢呋喃等极性溶剂。在反向色谱中，流动相一般以极性最大的水作为主体，然后按比例加入适量有机溶剂而成。常用的洗脱剂包括水、乙睛、甲醇、四氢呋喃等。洗脱液洗脱能力的
4、强弱顺序：水（最弱） 甲醇 乙睛 乙醇 四氢呋喃 二氯甲烷（最强）。二氯甲烷不溶于水，常用于清洗被强保留样品污染物的反相柱。为得到低的柱压，首选乙睛，其次是甲醇，再之是四氢呋喃。离子交换色谱的流动相通常采用具有一定pH的缓冲溶液。必要时可在流动相中加入甲醇以增加某些酸碱物质的溶解度，有时也可改变盐的浓度，以控制离子强度，减小某些样品组分的脱尾现象，从而使分离效果得到改善。高效液相色谱的固定相 高效液相色谱的固定相是对色谱柱中的固定相而言，它直接关系到柱效与分离度。常用的液固色谱固定相有硅胶和化学键合相。化学键合固定相是将各种不同的有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上形成
5、的一种高效液相色谱固定相载体，使色谱柱具有柱效高、使用寿命长、重现性好的特点。化学键合相根据极性可分为（1）非极性键合相：这类键合相表面基团为非极性烷基，如十八烷基、辛烷基、乙基、甲基苯基，可作反相色谱的固定相。常用的有十八烷基键合硅胶（ODS或C18）、辛烷基（C8）键合相、苯基键合相。（2）中等极性键合相：常见的是醚基键合相，其既可作正相色谱有可作反相色谱的固定相。（3）极性键合相：常用氨基、氰基键合相为极性键合。如分别将氨丙硅烷基及氰乙硅烷基键合在硅胶上制成用作正相色谱的固定相。氨基键合相是分离糖类常用的固定相。在高效液相色谱中， 70%80%的分析任务皆由反相键合相色谱来完成的。高效液
6、相色谱分析法的洗脱方式 色谱分析系统分离时，常用等度洗脱和梯度洗脱两种方式。梯度洗脱具有单位时间的分离能力增加，检测灵敏度提高的优点。 蛇葡萄属植物黄酮经甲醇溶液溶解，经高速离心分离，微孔滤膜过滤后直接进样，用C18反相色谱柱分离，经紫外检测器检测，与标准比较定量，用外标法计算含量。三、仪器与试剂（一）仪器 1、 高效液相色谱仪，美国waters 公司2、超声波脱气装置3、高速离心机4、0.45m 滤膜过滤器（滤头、滤膜及注射器组成）（二）试剂1、乙睛（色谱纯）2、二次蒸馏水3、冰醋酸（AR）4、流动相：乙睛-水-醋酸（ 1：9 ：0.1）混合液。临用时超声波脱气处理10min。5、3,5,7
7、,3,4,5六羟基2,3双氢黄酮标准贮备液：称取50mg (0.0001g)标准样品，用甲醇溶解至50mL，高速离心，用0.45m 滤膜过滤，备用。此时溶液浓度为1mg/mL。四、实验步骤（一）样品溶液配置称取蛇葡萄属植物黄酮提取物50mg (0.0001g)，用甲醇溶解至100mL，高速离心，用0.45m 滤膜过滤，备用。（二）样品测定液相色谱检测条件：（1）色谱柱 Symmetry C18, 5m，3.9150cm（2）流动相：乙睛 / 水 / 醋酸（3）检测波长：293nm（4）柱温：25（5）流速：1mL/min 等速洗脱。1、按仪器使用操作要求开启仪器，进入分析软件，设置相关的实验参
8、数及实验条件，用流动相平衡色谱柱，待检测基线平衡后，开始进样分析。2、标准工作曲线制备（1）用标准贮备液按一定比例配置成：0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0mg/mL五个不同浓度的黄酮标准使用液。 分别注入各不同浓度的黄酮标准使用液10L上机分析，记录各标样色谱峰的保留时间、峰面积（或峰高）。3、样品测定 注入样品溶液10L上机分析（可根据检测结果调整进样量），与标准样品峰保留时间作对照，确定植物黄酮峰的检出峰。记录样品峰的保留时间及峰面积（或峰高）。重复二次平衡检测。（三）实验结果记录：序号进样量（L）相当标样含量（g）检测峰保留时间（mi
9、n）峰面积峰高浓度1102浓度2104浓度3106浓度4108浓度51010样品10/（四）样品检测完毕对柱子的保存操作：样品检测完毕，以1.0mL/min流速，用流动相冲洗柱子30min，再用二次蒸馏水冲洗柱子20min，甲醇冲洗柱子30min保存柱子。五、结果计算：1、以标样的峰面积及所对应的含量（g）计算一次线性回归方程：Ym = aS+ b 式中：S峰面积； ym黄酮含量（g）2、外标法计算样品黄酮含量 X=式中： X样品植物黄酮（3,5,7,3,4,5六羟基2,3双氢黄酮）含量（g/100g）； Ym样品进样量黄酮含量（g）； m样品称取量（g）； V样品稀释体积（mL）； V1样品
10、进样量（mL）。六、注意事项及说明（一）使用色谱柱注意事项1、了解所使用柱子的性能。细看柱使用说明书，知道所用柱能承受的最大柱压、流速、pH值的应用范围（因与所配制的流动相pH值密切相关），柱温等参数。2、正确安装色谱柱。安装色谱柱时确定柱子安装方向十分重要，反向装柱有可能导致色谱柱报废，正常操作是根据柱身标记的箭头方向安装色谱柱，通用接头与色谱柱的松紧连接程度以不漏为宜，避免接头的变形或滑丝，影响柱子连接质量。所配置的预柱起到保护色谱柱寿命的作用，其参数与性能与相应的色谱柱相同，也有方向性。不同型号或不同用途的预柱不能互换使用，按实际情况及时更换保护预柱。3、根据实际情况正确选用流动相平衡分
11、析柱。安装更换色谱住后，首先了解系统当前管路中所存溶剂的性质：是极性溶剂或是非极性溶剂；是有机溶剂还是无机盐溶液，结合目前将更换柱子的性能，决定是否需应先用过渡溶剂冲洗系统后再装柱，否则容易由于流动相性质的不相溶，造成瞬间柱子的堵塞或检测器的堵塞。4、色谱柱的清洗及保存。分析检测完毕一定要对色谱柱进行认真冲洗，从清洗流动相到保存柱子试剂一般有一过度过程。例如使用C18反向柱分析样品，若分析流动相用的是盐缓冲溶液，检测完毕不可直接用有机溶剂保存柱子，而是先用纯水清洗系统和柱子约30min左右(几倍柱体积)，再用甲醇或乙腈保存柱子，避免由于盐在有机溶相中析出，导致检测池或管道堵塞的现象。GPC柱（
12、蛋白质分析柱）可用含有叠氮化钠的水溶液冲洗系统同时保存柱子。（二）对流动相及检测样品的要求 1、流动相的要求：使用色谱纯试剂及高纯水，使用前需进行脱气处理（可采用超声波脱气法）以除去流动相中溶解的气体（如氧气）以防止在洗脱过程中流动相由色谱柱至检测器时，因压力降低而产生气泡造成分析灵敏度下降，严重时甚至无法进行分析。2、待测样品的要求：固体样品用流动相溶解，然后高速离心除杂1015min（转速1.3万1.5万rpm），再用0.45m滤膜过滤，才能进样分析。液体样品应澄清透明，并与流动相有良好的互溶性。（三）色谱柱常见故障及原因。 1、柱压过高：微粒堵塞，或样品、流动相不可拟的吸附，或细菌生长污
13、染柱子。 2、柱效低：柱可能被污染，或流动相的pH值及组成不合适。3、实验重复性差：样品被污染，或样品与流动相不相溶，或样品不稳定，或流动相流失，或样品自身降解。4、柱回收率低 / 不出峰：出现“不可逆”吸附，或固定相过强或流动相过弱；或非特异性吸附。 5、管路不断出现气泡：流动相经正确的脱气处理后，管路仍不断出现气泡，可能是溶剂滤头不洁净或堵塞所至，可用10%硝酸溶液浸泡滤头，用蒸馏水彻底冲洗，再用超声波清洗器超声清洗20min。 溶剂滤头不允许在纯水中长期保存，需保存在50%甲醇或50%乙睛或0.05%叠氮化钠等具有防腐性能的溶液中。（四）检测器的维护。1、检测器维护：紫外检测器是高效液相
14、色谱仪最广泛使用的一种检测器，它是用氘灯作光源。氘灯是有寿命，检测过程尽量在较短时间内完成，洗柱或平衡柱时可在关灯状态下完成，以延长氘灯的寿命。 2、泵系统的维护：注意泵的最大工作速度、泵头排气阀的操作、进样阀的操作等。3、软件系统的保护：控制仪器运行的软件系统，不同网络相连，以免病毒袭击软件造成不能正常运行。4、注意工作间的干燥，有条件最好采用抽湿装置（中央空调最理想）。（五）作好实验检测工作记录的必要性。 每次实验完毕认真作好实验记录保证仪器正常运行的前提，不容忽视。因为只有进行相关参数的详细记录，如所使用色谱柱的类型、流动相的成分、柱压等才能确保另一使用者顺利进入实验，否则可能会出现干扰
15、下一实验者进行实验。例如检测系统由非极性系统向极性系统转换时（即原系统使用的是C18正相柱，所使用的流动相是非极性溶剂，而下一使用者是使用的是C18反相柱，所用的流动相是极性溶剂），这就存在一个过渡溶剂冲洗系统的过程，否则将对下一使用者所用的柱子造成很大的干扰以至无法正常使用。异丙醇、四氢呋喃是清洗系统残留正己烷非极性溶剂的试剂，具体操作：在检测系统处于开路的情况下（即溶剂不过色谱柱），先用过渡溶剂洗系统，而后再用纯水冲洗系统，最后向极性溶剂过渡。七、思考题1、简述样品前处理的操作要点及必要性。2、提高色谱分析检测结果准确性主要与哪些因素有关？3、高效液相分析法与紫外分光光度法测定黄酮含量结果的不同所在？4、正确使用及维护色谱柱应注意哪些问题？
