《微生物学实验.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微生物学实验.doc（21页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、目 录微生物学实验室规则1实验一 油镜的使用与保护3实验二 细菌的简单染色法6实验三 革兰氏染色法8实验四 培养基的制备10实验五 微生物的分离和纯化12实验六 微生物学实验中常用玻璃器皿的洗涤与处理14实验七 平板菌落计数法18实验八 IMVIC与硫化氢试验19微生物学实验室规则微生物学实验的对象有些为病原微生物，具有传染性，因此要求进入实验室后必须严格遵守以下规则：一、书包、衣物等挂放于室外，切勿带入室内。必需带入的书籍和文具等也应放置在非操作区，以免污染。二、进入实验室应穿好隔离衣、戴好帽子。无菌操作时必须戴好口罩。三、禁止在室内饮食、吸烟或用嘴湿润标签、铅笔等。四、认真进行各项实验，严
2、格掌握无菌技术。各个实验用品按指定地点存放，如吸过菌液的吸管、毛细滴管投放入来苏消毒缸内；用过的玻片、L形棒等放入装有消毒液的搪瓷缸内，绝对不要乱放在桌面上或冲洗水槽中。五、实验中发生差错或意外事故时，应立即报告老师及时处理。切勿隐瞒或自作主张不按规定处理，如万一发生有菌材料污染桌面、衣物等，应立即用抹布浸沾23%来苏（或5%石炭酸液），泡在污染部位，经半小时后方可抹去。如手上沾有活菌也用上述消毒液浸泡10分钟左右，再以肥皂及自来水反复洗净。六、要爱护室内仪器设备，按使用规则操作，并应节约使用实验材料。如不慎损坏了器材等，应报告教师。七、实验完毕应整顿桌面，关好水、电及煤气开关。需培养的材料要
3、标记组别、姓名等，送入孵箱培育。观察结果后的培养物等放污物筒，送消毒室处理、洗涮。八、实验完毕，脱下隔离衣、帽子，按要求将隔离衣反折、叠好，按座号放入柜内。然后用消毒液及自来水洗手后再离开实验室。另应轮流值日，负责实验室的卫生，水电，煤气及门窗的安全。九、未经许可不得将实验室内的物品及菌种携带出室外。9实验一 油镜的使用与保护一、目的要求l、学习并掌握油镜的原理和使用方法。2、复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分级成（图l）。在显微镜
4、的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要，与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油。这主要有如下二方面的原因：l、增加照明亮度油镜的放大倍数可达100，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大（图2）。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头)，有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头(图3)，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃
5、的折射率(n=1.55)相仿的镜油(通常用香柏油，其折射率n=1.52)。2增加显微镜的分辨率显微镜的分辨率或分辨力(resolution Or resolving power)是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：分辩率（最大可分辩距离）=/2 NA式中=光波波长；NA=物镜的数值孔径值。光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围(0.40.7um)，而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为：NA=n sin式中为光线最大入射角的半数，它取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中
6、最大只能达到120，而n为介质折射率。由于香柏油的折射率(1.52)比空气及水的折射率(分别为1.0和1.33)要高，因此以香柏油作为镜头与玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值(NA一般在1.21.4)要高于低倍镜、高倍镜等干镜(NA都低于1.0)。若以可见光的平均波长0.55 um 来计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4um的物体，而油镜的分辨率却可达到0.2um左右。三、器材 1菌种 待观察的微生物染色标本 2溶液或试剂 香柏油、二甲苯 3仪器或其他用具 显微镜、擦镜纸等四、操作步骤l、观察前的准备（l）显微镜的安置 置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边
7、缘约34 cm。镜检时姿势要端正，取放显微镜时应一手握住镜臂，一手托住底座，使显微镜保持直立、平稳，切忌用单手拎提；且不论使用单筒显做镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观寨边绘图或记录。（2光源调节 安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或凸面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。（3）根据使用者的个人情况，调节双简显微镜的目镜 双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有曲光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。（4）聚光
8、器数值孔径值的调节 调节聚光器虹彩光圈值与物镜的数值孔径值相符或略低。有些显微镜的聚光器只标有最大数值孔径值，而没有具体的光圈数刻度。使用这种显微镜时可在样品聚焦后取下一目镜，从镜筒中一边看着视野，一边缩放光圈，调整光圈的边缘与物镜边缘黑圈相切或略小于其边缘。因为各物镜的数值孔径值不同，所以每转换一次物镜都应进行这种调节。在聚光器数值孔径值确定后，若需改变光照强度，可通过升降聚光器或改变光源的亮度来实现，原则上不应再通过虹彩光圈的调节。当然，有关虹彩光圈、聚光器亮度及照明光源强度的使用原则也不是固定不变的，只要能获得良好的观察效呆，有时也可根据不同的具体情况灵活运用，不一定拘泥不变。2、显微观
9、察在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。（l）低倍镜观察 将待检细菌染色标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。下降10物镜，使其接近标本，用粗调节器慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再使用细调节器调节图像清晰。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。 在任何时候使用粗调节器聚焦物像时，必需养成先从侧面注视小心调节物镜靠近
10、标本，然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本进行准焦的习惯，以免因一时的误操作而损坏镜头及玻片。（2）高倍镜观察 在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。（3）油镜观察 在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜简升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径值超过1.0，还应在聚光镜与
11、载玻片之间也加滴香柏油，保证其达到最大的效能。调节照明使视野的亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。3、显微镜用毕后的处理（1）上升镜筒，取下载玻片。2）用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响观察。（3）用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。（4）将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。五、实验报告l 结果分
12、别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的待检细菌的形态，包括在三种情况下视野中的变化，同时注明物镜放大倍数和总放大率。2 思考题（l）用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之向加滴什么油？起什么作用？（2）试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？（3）影响显微镜分辨率的因素有哪些？实验二 细菌的简单染色法、目的要求 1、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法。 2、初步认识细菌的形态特征。 3、巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。 二、基本原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，
13、适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。图1 无菌操作过程当细菌分解糖类产酸使培养基H下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。三、器材1.菌种： 用待检细菌营养琼脂斜面培养物 2.染色剂 ： 吕氏碱性美蓝染液（或草酸铵结晶紫染液），
14、齐氏石炭酸复红染液。3.仪器或其他用具 ： 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等。图2 涂干，干燥和热固定四、操作步骤1.涂片取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环挑取12环）生理盐水（或蒸馏水）于玻片中央，用接环以无菌操作（图1，具体操作参照实验一）从待检细菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液（或液体培养物）涂片，可用接种环挑取23环直接涂于载玻片上（图2）。 载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。2.干燥 室温自然干燥。3.固定涂面朝上，通过火焰23次。此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，
15、以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。4.染色将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。吕氏碱性美蓝染色12 min；石炭酸复红（或草酸铵结晶紫）染色约l min。5.水洗倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。6.干燥自然干燥，或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。7.镜检涂片干后镜检。涂片必须完全干操后才能用油镜观察五、实验报告1.结果根据观察结果，绘出待检细菌的形态图。2.思考题（1）你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？（2）为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？（3）如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢？实验三 革兰氏染色法一、目的与要求1.学习并初步掌握革兰氏染色法。2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中
