《骨髓微环境中SMAD信号传递调控CXCL12的表达》由会员分享,可在线阅读,更多相关《骨髓微环境中SMAD信号传递调控CXCL12的表达(7页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、ABSTRACT最近我们报导了离体情况下,SMAD独立性骨形态生成蛋白 4 ( BMP4)信号通路在造血 干细胞/祖细胞(HSPCS中活化,影响了它们导向骨髓(BM)的过程。本文中,我们评估了活体中,影响BM龛是否会导致 BMP信号传递过程发生改变。我们揭示了注入BMP拮抗剂头蛋白(Noggin)来抑制SMAD依赖性BMP信号转导,显著增加了 BM血浆中CXCL12的 水平,增强了植入 HSPCS的导向与血管生成。 反过来,注入BMP7而不是BMP4,造成HSPC 导向能力下降。利用ST2细胞充当BM龛的体外模型,我们发现在中和抗 BMP4抗体,NGN, 或背成形因子 ( Dorsomorph
2、in, DM )同时敲除掉 Smad1/5 及 BMP4 的条件下孵化, 所有这些 都增强了 CXCL12的产生。染色质免疫沉淀分析识别出了CXCL12启动子中与SMAD4结合的元件。删除这个元件后,观察到CXCL12启动子活性增加,并且 NGN或DM不再影响Cxcl12表达。有趣的是,BMP7表达只出现在成骨细胞中,不出现在其它龛成分中。因此,我们将 SMAD依赖性BMP信号转导描述为 BM龛中一种新的 CXCL12生产调控因子,影响 HSPC的 导向,移植成活以及运动。INTRODUCTION在治疗多种类型癌症,骨髓( BM)衰竭中,遗传性代谢障碍,以及严重先天性免疫缺 陷时,常常使用造血
3、干细胞 (HSC移植(1)。在骨髓中,HSCs与其所处的微环境相互作用, 这种微环境也称为“龛”。最初提出HSCs与成骨细胞有关(2),然而后来发现许多 HSCs与 窦状小管内皮有关(3)。移植后的造血重建,需要HSCs有效地导向到BM龛中。多种从细胞分泌到BM龛中的细胞因子和生长因子调控着HSCs的维持和分化(4)。HSCs也表达一系列黏附受体,接受BM中不同类型细胞分泌的配体,使得植入的HSCs可以导向和定居(5)。黏附受体表达情况的改变,或其与龛中相应受体之间相互作用的改变,不止会引起HSC动员,也会使HSC难以维持(6)。细胞因子 CXCL12及其G蛋白耦联受体(GPCR CXCR4在
4、造血干细胞/祖细胞迁移到 BM,以及定居于龛的过程中起主要作用(711)。基于Mx-cre技术,将CXCR4从成年小鼠HSCs中条件性删除,显示出CXCR4对维持原始HSCs很重要(10)。这一相互作用对于人类及小鼠HSCs植入受辐射处理后的宿主体内后,进行导向的过程十分重要(10, 11)。由BM龛细胞产生的一种 CXCL12细胞因子浓度梯度,吸引着植入的HSCs前来,它们首先黏附于内 皮并滚动,然后通过穿内皮迁移,穿入组织(12)。根据表达 CXCL12的细胞类型,CXCL12不同地影响HSCs的维持,和谱系定型祖细胞的维持(13,14)。尽管人们做了很多工作来评估分泌出来的CXCL12的
5、更新与失活,关于 Cxcl12基因表达调控的方面仍然所知不多。CXCL12的表达在缺氧条件下升高,这是由 HIF-1a结合在其启动子上所致(15)。诸如IL-1好IL-6这样的炎症刺激,以一种CCAAT增强子结合蛋白3 (c/EBP B)依赖性方式诱导 CXCL12表达(16)。另外,Cxcl12启动子区域,除了别的以外,还含有 Sp1,AP1,NFkB, PARP1 结合位点(17 )。骨形态生成蛋白(BMPs)是中胚层分化的主要调控因子,在造血系统的发育中起重要 作用( 18, 19)。另外,它们在骨组织的形成与动态平衡中起重要作用,这形成了关键性的 BM 龛( 20)。 BMPs 可以调
6、控出生后时期的骨动态平衡,并调控骨量来影响成年造血过程, 这一点虽然已经了解得很清楚,但尚不清楚BMP-介导的成骨生物学上的变化是否会直接影响HSPC的功能。以前,人们发现TGF-3可以影响基质细胞系中 Cxcl12的表达(26)。这里,我们揭示了 BM龛中,通过 SMAD依赖性BMP信号转导途径调控 CXCL12的表达,影响了 HSCs的导向与移植成活,也影响造血祖细胞的动员。MATERIAL AND METHODS此处暂略RESULTS系统性抑制SMAD依赖性BMP信号转导途径增强了 HSCs的导向与移植成活为了评估SMAD依赖性BMP信号转导途径在成年造血过程中的作用,我们对经亚致死 量
7、辐射处理过的 CD45.2小鼠静注PBS/NGNNGN与BMPs结合,抑制其与其受体的结合(34)。 大约 50000 个来自 CD45.1 小鼠的 BM 细胞被移植到经处理后的 CD45.2 小鼠中,以评估在 BMP 信号转导途径发生改变后,移植成活方面是否有任何变化(Fig.1A,1B)。 我们观察到移植后第 4, 8 及 12 周,在未注射 NGN 的原始受体内的供体源性嵌合现象连续增加 。另外, 对继发受体的分析显示,注入 NGN 的小鼠中,长期供体源性的与 BM 的嵌合现象增加了 3 倍。这些研究揭示了SMAD信号转导途径的抑制显著增加了HSCs的长期群体恢复( repopulati
8、on )能力。为了确定注射了 NGN的小鼠中,HSPCs的移植成活增加是否是由导向能力增强所致,所有的BM细胞或lin-细胞被注射到受到致死剂量辐射的动物中,移植后16小时,定居在BM内的克隆形成细胞(CFCs的总数被统计出来,并与注射的CFCs的数量进行比较(Fig.1C)。 植入的CFCs在 BM中定居的比例,在那些NGN处理前的动物中明显更高。 换言之,注射BMP7 而不是BMP4,会引起植入HSCs的导向能力下降。下一步我们检验了注入NGN后,在龛内表达的关键造血调控因子相应的表达情况(Supporti ng In formation Fig.1A)。向小鼠注入PBS/NGN后24小时
9、,用压碎与胶原酶I处理分离出后肢骨中的BM细胞。用MACS分离的lin-CD45BM龛细胞来做qRT-PCR以定量其基因表达情况。在所有被分析的基因中( Cd44, Cxcl12, Icam1 , Vcam1, Mmp7 , Mmp9 , Upa, Ang1 , Opn, Scf,以及 Ccl2),我们发现 Cxcl12 的表达在NGN注射后增加了 2倍(Supporti ng In formation Fig.1A)。我们重复了这些实验, 评估在注射PBS/BMP7/NGN之后,除了 Cxcl12表达之外的SMAD目标基因的表达,以分析 SMAD信号转导途径的状态(Fig.1D)。SMAD目
10、标基因Id2 , Id3,以及Runx2的表达在BMP7 注入后增高了,而与注射 PBS的对照组相比,注射 NGN后的小鼠中,这些目标基因的表达 下降了,这证实了注射的蛋白质对龛细胞中SMAD依赖性BMP信号转导途径的反应性调控(Fig.1D)。另外,注入 BMP7增加了 lin-CD45-BM细胞中SMAD目标基因的表达,而减少了 Cxcl12的表达,这与 NGN注射的结果相反。之后我们测试了注入DM,一种特异性 SMAD磷酸化抑制剂(35),是否会产生类似 NGN的效果。我们观察到注射 DM也能引起lin-CD45BM 细胞中Cxcl12表达的增加(Supporti ng In forma
11、tion Fig.1B )。这也伴随着移植后 16小时内定 居在BM中的植入 CFCs比例增加(Supporti ng In formation Fig.1C )。我们也通过对 BM血浆的 ELISA评估了由BM龛细胞分泌的CXCL12蛋白(Fig.1E)。与基因表达结果一致,NGN和BMP7 也影响了 BM血浆中CXCL12蛋白的水平。我们没有发现外周血 CXCL12水平有任何变化(PB; Fig.1F)。在 BM 基质细胞中抑制 SMAD 介导的 BMP 信号转导途径强化了CXCL1的表达由于CXCL12是已知的最重要的将 HSCs趋向到龛中的化学因子, 我们研究其表达程度的 改变是否会引
12、起 HSPCs向经过NGN处理的龛中迁移。我们使用了成熟BM基质源性细胞系ST2作为离体模型,用小室转移系统(transwell system )测定迁移(Fig.2A)。我们评估了谱 系耗竭的(lineage-depleted)BM细胞(被PKH-26标记),向ST2细胞趋化迁移的过程,这 种ST2细胞要么受了 NGN或DM处理,要么就没受处理。DM是一种BMP信号转导途径非常强力的小分子抑制剂,通过选择性抑制 BMP受体I来发挥作用。 用DM抑制BMP信号转导途径引起 HSPCs向ST2细胞迁移(Fig.2A)。增加NGN也使得HSPCs向ST2细胞的趋化过 程增强,提示有信号途径的自分泌
13、调节参与进来。由于静注BMP7抑制了植入HSPC啲导向,我们也分析了 HSPCs向经BMP7处理过的ST2细胞迁移的可能性。但是,和活体中BMP7对 HSPCs定居产生的作用不同,我们没有发现离体条件下BMP7对迁移有任何影响。由于注射 BMP7/NGN造成SMAD信号转导途径改变,并伴有 BM龛中Cxcl12的表达变 化。我们检验了经处理的 ST2中Cxcl12的表达是否也有相同的变化。在有 BMP抑制剂NGN 或DM存在的情况下培养两天,ST2细胞中,Cxcl12的表达与对照组相比,用 qRT-PCR佥测(Fig.2B)。我们观察到ST2细胞中,在SMAD信号途径受到 NGN或DM抑制的情
14、况下,Cxcl12 表达情况显著增高,我们测定了那些受DM或未受DM处理的ST2细胞的上清液中 CXCL12蛋白的水平,进一步扩展了这些发现(Fig.2C)。与基因表达的数据一致,我们发现经DM处理培养的ST2细胞,与对照组相比,CXCL12的分泌水平增高。这些结果被我们做的荧光素酶启动子试验进一步证实,在该试验中,CXCL12启动子被复制到pGL3载体的荧光素酶基因上游( the CXCL12promoter was cloned upstream of the luciferase gene of the pGL3 vector )。 ST2 细胞转染了含有 CXCL12启动子的载体,然后
15、用双重荧光素酶试验来评估受对照载体处理,或受DM/NGN抑制剂处理后荧光素酶的活性(Fig.2D)。NGN和DM都增强了 CXCL12介导的荧光素酶表达,不过NGN的增强效果要弱于 DM。除了 ST2细胞,我们还用原始 BM基质细 胞来做qRT-PCR评估Cxcl12的表达是否受到了 SMAD信号途径改变的影响(Fig.2E)。就像 对ST2细胞的影响那样,用DM或NGN抑制SMAD介导的BMP信号途径,也诱导Cxcl12在 原始 BM 基质细胞中表达增加。这些结果揭示了在那些属于 BM 龛的细胞中,抑制 BMP 信 号途径增强了 Cxcl12的表达。此外,NGN在Cxcl12表达上的作用提示
16、,SMAD介导的BMP信号途径在基质细胞中确实是活化的,这或是由FBS中的BMPs存在所致,或是由这些细胞中的BMPs所致。ST2细胞中Cxcl12的表达受到自分泌形式的调控在我们揭示ST2细胞中SMAD依赖性BMP信号途径的抑制增强了 HSPCs的趋化并增加 了 CXCL12的产量时,通过增加 BMP7进行的刺激在离体情况下却没有这些效果。但是,在 我们的活体研究中,注射 BMP7来系统性诱导 SMAD信号途径,引起了 CXCL12表达和分泌 增加。我们设想这种差异应当归于BM龛细胞和ST2细胞中BMP受体的表达类型不同。为了探究这一问题,我们首先用qRT-PCR评估了 Bmp2, Bmp4, Bmp6, Bmp7,以及Bmp8a 在ST2细胞及原始 BM源性lin C