《骨髓微环境中SMAD信号传递调控CXCL12的表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《骨髓微环境中SMAD信号传递调控CXCL12的表达（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、ABSTRACT最近我们报导了离体情况下，SMAD独立性骨形态生成蛋白 4 （ BMP4）信号通路在造血 干细胞/祖细胞（HSPCS中活化，影响了它们导向骨髓（BM）的过程。本文中，我们评估了活体中，影响BM龛是否会导致 BMP信号传递过程发生改变。我们揭示了注入BMP拮抗剂头蛋白（Noggin）来抑制SMAD依赖性BMP信号转导，显著增加了 BM血浆中CXCL12的 水平，增强了植入 HSPCS的导向与血管生成。 反过来，注入BMP7而不是BMP4,造成HSPC 导向能力下降。利用ST2细胞充当BM龛的体外模型，我们发现在中和抗 BMP4抗体，NGN, 或背成形因子 （ Dorsomorph
2、in, DM ）同时敲除掉 Smad1/5 及 BMP4 的条件下孵化， 所有这些 都增强了 CXCL12的产生。染色质免疫沉淀分析识别出了CXCL12启动子中与SMAD4结合的元件。删除这个元件后，观察到CXCL12启动子活性增加，并且 NGN或DM不再影响Cxcl12表达。有趣的是，BMP7表达只出现在成骨细胞中，不出现在其它龛成分中。因此，我们将 SMAD依赖性BMP信号转导描述为 BM龛中一种新的 CXCL12生产调控因子，影响 HSPC的 导向，移植成活以及运动。INTRODUCTION在治疗多种类型癌症，骨髓（ BM）衰竭中，遗传性代谢障碍，以及严重先天性免疫缺 陷时，常常使用造血
3、干细胞 （HSC移植（1）。在骨髓中，HSCs与其所处的微环境相互作用， 这种微环境也称为“龛”。最初提出HSCs与成骨细胞有关（2），然而后来发现许多 HSCs与 窦状小管内皮有关（3）。移植后的造血重建，需要HSCs有效地导向到BM龛中。多种从细胞分泌到BM龛中的细胞因子和生长因子调控着HSCs的维持和分化（4）。HSCs也表达一系列黏附受体，接受BM中不同类型细胞分泌的配体，使得植入的HSCs可以导向和定居（5）。黏附受体表达情况的改变，或其与龛中相应受体之间相互作用的改变，不止会引起HSC动员，也会使HSC难以维持（6）。细胞因子 CXCL12及其G蛋白耦联受体（GPCR CXCR4在
4、造血干细胞/祖细胞迁移到 BM，以及定居于龛的过程中起主要作用（711）。基于Mx-cre技术，将CXCR4从成年小鼠HSCs中条件性删除，显示出CXCR4对维持原始HSCs很重要（10）。这一相互作用对于人类及小鼠HSCs植入受辐射处理后的宿主体内后，进行导向的过程十分重要（10, 11）。由BM龛细胞产生的一种 CXCL12细胞因子浓度梯度，吸引着植入的HSCs前来，它们首先黏附于内 皮并滚动，然后通过穿内皮迁移，穿入组织（12）。根据表达 CXCL12的细胞类型，CXCL12不同地影响HSCs的维持，和谱系定型祖细胞的维持（13，14）。尽管人们做了很多工作来评估分泌出来的CXCL12的
5、更新与失活，关于 Cxcl12基因表达调控的方面仍然所知不多。CXCL12的表达在缺氧条件下升高，这是由 HIF-1a结合在其启动子上所致（15）。诸如IL-1好IL-6这样的炎症刺激，以一种CCAAT增强子结合蛋白3 （c/EBP B）依赖性方式诱导 CXCL12表达（16）。另外，Cxcl12启动子区域，除了别的以外，还含有 Sp1，AP1，NFkB, PARP1 结合位点（17 ）。骨形态生成蛋白（BMPs）是中胚层分化的主要调控因子，在造血系统的发育中起重要 作用（ 18， 19）。另外，它们在骨组织的形成与动态平衡中起重要作用，这形成了关键性的 BM 龛（ 20）。 BMPs 可以调
6、控出生后时期的骨动态平衡，并调控骨量来影响成年造血过程， 这一点虽然已经了解得很清楚，但尚不清楚BMP-介导的成骨生物学上的变化是否会直接影响HSPC的功能。以前，人们发现TGF-3可以影响基质细胞系中 Cxcl12的表达（26）。这里，我们揭示了 BM龛中，通过 SMAD依赖性BMP信号转导途径调控 CXCL12的表达，影响了 HSCs的导向与移植成活，也影响造血祖细胞的动员。MATERIAL AND METHODS此处暂略RESULTS系统性抑制SMAD依赖性BMP信号转导途径增强了 HSCs的导向与移植成活为了评估SMAD依赖性BMP信号转导途径在成年造血过程中的作用，我们对经亚致死 量
7、辐射处理过的 CD45.2小鼠静注PBS/NGNNGN与BMPs结合，抑制其与其受体的结合(34)。 大约 50000 个来自 CD45.1 小鼠的 BM 细胞被移植到经处理后的 CD45.2 小鼠中，以评估在 BMP 信号转导途径发生改变后，移植成活方面是否有任何变化(Fig.1A,1B)。 我们观察到移植后第 4， 8 及 12 周，在未注射 NGN 的原始受体内的供体源性嵌合现象连续增加 。另外， 对继发受体的分析显示，注入 NGN 的小鼠中，长期供体源性的与 BM 的嵌合现象增加了 3 倍。这些研究揭示了SMAD信号转导途径的抑制显著增加了HSCs的长期群体恢复( repopulati
8、on )能力。为了确定注射了 NGN的小鼠中，HSPCs的移植成活增加是否是由导向能力增强所致，所有的BM细胞或lin-细胞被注射到受到致死剂量辐射的动物中，移植后16小时，定居在BM内的克隆形成细胞(CFCs的总数被统计出来，并与注射的CFCs的数量进行比较(Fig.1C)。 植入的CFCs在 BM中定居的比例，在那些NGN处理前的动物中明显更高。 换言之，注射BMP7 而不是BMP4,会引起植入HSCs的导向能力下降。下一步我们检验了注入NGN后，在龛内表达的关键造血调控因子相应的表达情况(Supporti ng In formation Fig.1A)。向小鼠注入PBS/NGN后24小时
9、，用压碎与胶原酶I处理分离出后肢骨中的BM细胞。用MACS分离的lin-CD45BM龛细胞来做qRT-PCR以定量其基因表达情况。在所有被分析的基因中( Cd44, Cxcl12, Icam1 , Vcam1, Mmp7 , Mmp9 , Upa, Ang1 , Opn, Scf,以及 Ccl2),我们发现 Cxcl12 的表达在NGN注射后增加了 2倍(Supporti ng In formation Fig.1A)。我们重复了这些实验， 评估在注射PBS/BMP7/NGN之后，除了 Cxcl12表达之外的SMAD目标基因的表达，以分析 SMAD信号转导途径的状态(Fig.1D)。SMAD目
10、标基因Id2 , Id3,以及Runx2的表达在BMP7 注入后增高了，而与注射 PBS的对照组相比，注射 NGN后的小鼠中，这些目标基因的表达 下降了，这证实了注射的蛋白质对龛细胞中SMAD依赖性BMP信号转导途径的反应性调控(Fig.1D)。另外，注入 BMP7增加了 lin-CD45-BM细胞中SMAD目标基因的表达，而减少了 Cxcl12的表达，这与 NGN注射的结果相反。之后我们测试了注入DM，一种特异性 SMAD磷酸化抑制剂(35),是否会产生类似 NGN的效果。我们观察到注射 DM也能引起lin-CD45BM 细胞中Cxcl12表达的增加(Supporti ng In forma
11、tion Fig.1B )。这也伴随着移植后 16小时内定 居在BM中的植入 CFCs比例增加(Supporti ng In formation Fig.1C )。我们也通过对 BM血浆的 ELISA评估了由BM龛细胞分泌的CXCL12蛋白(Fig.1E)。与基因表达结果一致，NGN和BMP7 也影响了 BM血浆中CXCL12蛋白的水平。我们没有发现外周血 CXCL12水平有任何变化(PB; Fig.1F)。在 BM 基质细胞中抑制 SMAD 介导的 BMP 信号转导途径强化了CXCL1的表达由于CXCL12是已知的最重要的将 HSCs趋向到龛中的化学因子， 我们研究其表达程度的 改变是否会引
12、起 HSPCs向经过NGN处理的龛中迁移。我们使用了成熟BM基质源性细胞系ST2作为离体模型，用小室转移系统(transwell system )测定迁移(Fig.2A)。我们评估了谱 系耗竭的(lineage-depleted)BM细胞(被PKH-26标记)，向ST2细胞趋化迁移的过程，这 种ST2细胞要么受了 NGN或DM处理，要么就没受处理。DM是一种BMP信号转导途径非常强力的小分子抑制剂，通过选择性抑制 BMP受体I来发挥作用。 用DM抑制BMP信号转导途径引起 HSPCs向ST2细胞迁移(Fig.2A)。增加NGN也使得HSPCs向ST2细胞的趋化过 程增强，提示有信号途径的自分泌
13、调节参与进来。由于静注BMP7抑制了植入HSPC啲导向，我们也分析了 HSPCs向经BMP7处理过的ST2细胞迁移的可能性。但是，和活体中BMP7对 HSPCs定居产生的作用不同，我们没有发现离体条件下BMP7对迁移有任何影响。由于注射 BMP7/NGN造成SMAD信号转导途径改变，并伴有 BM龛中Cxcl12的表达变 化。我们检验了经处理的 ST2中Cxcl12的表达是否也有相同的变化。在有 BMP抑制剂NGN 或DM存在的情况下培养两天，ST2细胞中，Cxcl12的表达与对照组相比，用 qRT-PCR佥测(Fig.2B)。我们观察到ST2细胞中，在SMAD信号途径受到 NGN或DM抑制的情
14、况下，Cxcl12 表达情况显著增高，我们测定了那些受DM或未受DM处理的ST2细胞的上清液中 CXCL12蛋白的水平，进一步扩展了这些发现(Fig.2C)。与基因表达的数据一致，我们发现经DM处理培养的ST2细胞，与对照组相比，CXCL12的分泌水平增高。这些结果被我们做的荧光素酶启动子试验进一步证实，在该试验中，CXCL12启动子被复制到pGL3载体的荧光素酶基因上游( the CXCL12promoter was cloned upstream of the luciferase gene of the pGL3 vector )。 ST2 细胞转染了含有 CXCL12启动子的载体，然后
15、用双重荧光素酶试验来评估受对照载体处理，或受DM/NGN抑制剂处理后荧光素酶的活性(Fig.2D)。NGN和DM都增强了 CXCL12介导的荧光素酶表达，不过NGN的增强效果要弱于 DM。除了 ST2细胞，我们还用原始 BM基质细 胞来做qRT-PCR评估Cxcl12的表达是否受到了 SMAD信号途径改变的影响(Fig.2E)。就像 对ST2细胞的影响那样，用DM或NGN抑制SMAD介导的BMP信号途径，也诱导Cxcl12在 原始 BM 基质细胞中表达增加。这些结果揭示了在那些属于 BM 龛的细胞中，抑制 BMP 信 号途径增强了 Cxcl12的表达。此外，NGN在Cxcl12表达上的作用提示
16、，SMAD介导的BMP信号途径在基质细胞中确实是活化的，这或是由FBS中的BMPs存在所致，或是由这些细胞中的BMPs所致。ST2细胞中Cxcl12的表达受到自分泌形式的调控在我们揭示ST2细胞中SMAD依赖性BMP信号途径的抑制增强了 HSPCs的趋化并增加 了 CXCL12的产量时，通过增加 BMP7进行的刺激在离体情况下却没有这些效果。但是，在 我们的活体研究中，注射 BMP7来系统性诱导 SMAD信号途径，引起了 CXCL12表达和分泌 增加。我们设想这种差异应当归于BM龛细胞和ST2细胞中BMP受体的表达类型不同。为了探究这一问题，我们首先用qRT-PCR评估了 Bmp2, Bmp4, Bmp6, Bmp7，以及Bmp8a 在ST2细胞及原始 BM源性lin C
