《木薯酒精发酵实验》由会员分享，可在线阅读，更多相关《木薯酒精发酵实验（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、木薯酒精发酵实验生物工程091 姬跃莹 200900606030一、实验目的1. 掌握酒精发酵的基本原理。2. 掌握酒精发酵过程的相关技术操作及调控。二、实验原理酒精发酵是在厌氧条件下，己糖分解为乙醇并释放出二氧化碳。酒精发酵的 类型有3种：即通过EMP途径的酵母菌酒精发酵、通过HMP途径的细菌酒精发 酵和通过 ED 途径的细菌酒精发酵酵母菌通过 EMP 途径分解己糖生成丙酮酸，在厌氧条件和微酸性条件下， 丙酮酸则继续分解为乙醇。而如果在碱性条件或者培养基中加有亚硫酸盐时，则 发酵的主要产物是甘油，这也是工业的甘油发酵。因此，如果要用酵母进行酒精 发酵，就必须控制发酵液的微酸性条件。三、实验材
2、料1. 菌种酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiaGGSF162. 培养基YPD （Yeast extract Peptone Dextrose,酵母浸出物）斜面培养基：葡萄糖20 g/L,酵母膏 10 g/L,蛋白胨 10 g/L,琼脂 15 g/L,自然 pH, 115C灭菌 20min。木薯粉一级种子培养基：料水比1： 4的木薯粉，经液化糖化，调节pH为4.5, 115C灭菌20min,冷却，添加尿素母液至灭菌醪液中。木薯粉二级种子培养基：料水比1： 3的木薯粉，经液化糖化，调节pH为 4.5, 115C灭菌20min,冷却，添加尿素母液至灭菌醪液中。木薯粉发酵培养基：
3、料水比1： 2.3的木薯粉，经液化糖化，调节pH至4.5, 添加相应营养盐至终浓度为 MgSO47H2O 0.45g/L, KH2PO4 1.5g/L, CaCl2 0.2g/L, 115C灭菌20min,冷却，添加尿素母液至灭菌醪液中。3. 溶液及试剂*2.5g/L的标准葡萄糖溶液：称取105C左右烘干至恒重的葡萄糖2.5g,加水 溶解，加浓盐酸5mL,蒸馏水定容至1000mL容量瓶。3mol/L尿素母液：尿素18.02g定容至100mL，以微孔滤膜过滤备用。使用 时按每100g木薯粉0.25g尿素量添加。*用NH4C1代替尿素，使用时终浓度为0.6g/L。*菲林甲液：69.3g硫酸铜加蒸馏
4、水定容至lOOOmL。*菲林乙液：346g酒石酸钾钠加100g氢氧化钠，加蒸馏水定容至lOOOmL。 2mol/LHCl溶液：浓盐酸5.6mL，定容至100mL容量瓶中。*6mol/LHCl溶液：浓盐酸500mL，定容至lOOOmL容量瓶中2mol/L H2SO4溶液：吸取浓硫酸5.6mL缓慢加入适量水中，冷却后定容至 100mL。*200g/LNaOH溶液：200g氢氧化钠定容于lOOOmL容量瓶中。1.5mol/L NaOH溶液：60g氢氧化钠定容于lOOOmL容量瓶中。主要药品与试剂来源见表 l产品名称规格产地/厂家葡萄糖AR天津市科密欧化学试剂开发中心酵母浸膏BR广东环凯微生物科技有限
5、公司细菌学蛋白胨BR广东环凯微生物科技有限公司琼脂粉AR广东环凯微生物科技有限公司磷酸二氢钾AR广东汕头市西陇化工有限公司无水氯化钙AR广东汕头市西陇化工有限公司氯化铵AR广东化学试剂厂七水硫酸镁AR广东台山粤侨试剂塑料有限公司氢氧化钠AR广东省化学试剂工程技术开发中心盐酸AR广东汕头市西陇化工有限公司硫酸AR广东省廉江市爱廉化试剂有限公司酒石酸钾钠AR天津市大茂化学试剂开发中心硫酸铜AR广东汕头市西陇化工有限公司次甲基蓝AR天津市北联精细化学试剂有限公司尿素AR广东台山粤侨试剂塑料有限公司表 l 主要药品与试剂Table l Main chemicals and reagents4. 主要仪
6、器设备本试验所使用的主要仪器设备见表2。产品名称规格产地/厂家全温度恒温调速摇床HWY-2112上海智城分析仪器制造有限公司柜微电脑控制生化培养LRH25011广东省医疗器械厂箱电子天平T 500美国双杰兄弟（集团）有限公司电子分析天平AB104N梅特勒托利多仪器（上海）有限公 司河北武强县同辉仪表厂酒精浓度计MC全自动新型鼓风干燥ZFD 5230上海智城分析仪器制造有限公司箱立式压力蒸汽消毒器628B 2铁岭市医疗器械总厂不锈钢电热蒸馏水器15KW 20L上海博讯实业有限公司医疗设备厂光波炉YS A007B广东省茂名市亚洲电器有限公司722光栅分光光度计SFZ上海精密科学仪器有限公司旋涡混合
7、器1606017101XW80A上海精科实业有限公司表2 主要仪器设备Table 2 Main instruments and equipments四、方法步骤1酿酒酵母GGSF16发酵性能的测定（1）酵母菌种培养流程 酵母菌种培养流程：试验室保藏菌种斜面活化一级种子培养二 级种子培养接种发酵斜面活化:无菌操作将试验室保存的酵母GGSF16接种到斜面培养基上,32C 培养 1d-2d。一级种子培养:无菌条件下接种一环斜面酵母于盛有 10mL 一级种子培养液 的试管中，在培养箱中32C恒温培养12h。二级种子培养：无菌条件下按 2%的接种量接种一级种子培养液至含 98mL 二级种子培养基的三角瓶
8、中，置于32C恒温培养12h。(2) 酿酒酵母 GGSF16 木薯粉酒精发酵性能的测定称取过40目筛的木薯粉以料水比1： 2.3的比例混合于60C的自来水中，按 10U/g木薯粉的量加入液化酶，搅拌混匀后 60C下保温30min。迅速升温到 100C105C,保温液化2h后降温至60Co以调pH至4.5,加入150U/g木薯粉 的糖化酶，并降至到32C并保温30min。按NH4C1 0.6g/L(或尿素0.25g/100g木薯 粉)，MgSO47H2O 0.45g/L, KH2PO4 1.5g/L，CaCl20.2g/L 的量加到醪液中，调节 pH4.5。按接种量为10%接种酿酒酵母GGSF1
9、6至液化糖化后的醪液中，32C发 酵，转速为150r/min。测定初总糖，初还原糖，酒精度，残总糖和残还原糖。2. 分析方法2.1 还原糖的测定(1) 试样的制备：称取糖化醪试样10mL定容至250mL，过滤，滤液摇匀备 用。(2) 斐林试剂所消耗葡萄糖标准溶液的体积标定A. 预备试验：吸取费林甲液、乙液及标准葡萄糖液各5mL于250mL三角 瓶内，加20mL水，摇匀，加入数颗玻璃珠，在电炉上加热沸腾，加入亚甲基兰 溶液 2 滴，盖住表面皿，保持沸腾以避免空气中氧气的干扰，在沸腾状态下用标 准葡萄糖液滴定至蓝色消失为止。记录标准葡萄糖液消耗的总体积。B. 正式试验：吸取费林甲液、乙液及标准葡萄
10、糖液各5mL于250mL三角瓶 内，加水20mL，加入少于预备试验1毫升的2.5g/L标准葡萄糖溶液，加入玻璃 珠数颗，置电炉上沸腾2min，滴入亚甲基兰2滴，沸腾状态下1min内以标准葡 萄糖溶液滴定，至溶液蓝色刚好消失。记录标准葡萄糖液消耗的总体积，并做平 行试验，使两次滴定结果之差在0.1mL之内。(3) 试样还原糖的测定A. 预备试验：吸取费林甲液、乙液及待测液各5mL于250mL三角瓶内， 加20mL水，摇匀，加入数颗玻璃珠，在电炉上加热沸腾，加入亚甲基兰溶液2 滴，盖住表面皿，保持沸腾以避免空气中氧气的干扰，在沸腾状态下用标准葡萄 糖液滴定至蓝色消失为止。记录标准葡萄糖液消耗的总体
11、积。B. 正式试验：吸取费林甲液、乙液及待测液各5mL于250mL三角瓶内，加 水20mL，加入少于预备试验1毫升的2.5g/L标准葡萄糖溶液，加入玻璃珠数颗， 置电炉上沸腾2min，滴入亚甲基兰2滴，沸腾状态下1min内以标准葡萄糖溶液 滴定，至溶液蓝色刚好消失。记录标准葡萄糖液消耗的总体积，并做平行试验， 使两次滴定结果之差在0.1mL之内。2.2 总糖的测定试样制备：称取10mL糖化醪试样于250mL三角瓶中，加70mL水和20mL 质量分数为20%的HC1溶液，沸水浴中水解60min,冰水迅速冷却，以200g/L 的NaOH溶液中和到微酸性，过滤定容到250mL，滤液摇匀备用。预备试验
12、：同还原糖的测定。正式试验：同还原糖的测定。2.3 酒精度测定准确量取发酵醪100mL，用100mL蒸馏水洗涤至500mL蒸馏瓶中，加入 5mL2mol/L 的 NaOH 溶液，消泡剂 2 滴，玻璃珠数个，加热蒸馏收集于 100mL 量筒中，待馏出液接近刻度时（约96mL）取下，加水至刻度，摇匀，用酒精计 和温度计同时测酒精和温度，并换算成20C的酒度（, v/v）。2.4. CO2失重测定方法接种完毕后，用电子天平称量发酵瓶，在发酵过程中每 4h 称重一次（称重 前应先摇晃发酵瓶，以除去发酵醪液中的CO2），直至CO2失重Vo.2g，发酵结 束。2.5 计算方法（1）还原糖的计算还原糖含量（
13、以葡萄糖计，g/100mL） = （A-B）X 0.0025 X 250/5 X 1/10 X 100A滴定斐林试剂所消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL；B斐林试剂加入样品滤液后所消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL；0.0025标准葡萄糖溶液的浓度，g/mL；250样品稀释体积，mL；5稀释糖化醪的体积，mL；10量取糖化醪的体积，mL。（2）总糖的计算总糖含量（以葡萄糖计，g/100mL） = （A-B） x 0.0025 x 250/5 x 1/10 x 100A滴定斐林试剂消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL；B斐林试剂加入样品滤液后消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL；0.0025标准葡萄糖溶液的浓度，g
14、/mL；250样品稀释体积，mL；5稀释糖化醪的体积，mL；10量取糖化醪的体积，mL。（3） 发酵效果的判定指标 糖的利用率反映总糖在发酵前后利用的百分率。糖的利用率=（初总糖-残总糖）/初总糖X100%实际出酒率反映发酵醪液酒精质量与初总糖的百分比。实际出酒率=酒精度xO.789/初总糖X100%发酵效率反映实际出酒率与理论实际出酒率的百分比。发酵效率=酒精度xO.789/ （初总糖xO.511） X100%糖酒转化率反映菌种发酵前后利用总糖的能力。糖酒转化率=酒精度X 0.789/ （初总糖-残总糖）X100%附加信息木 薯 粉 的 淀 粉 含 量 为 ： 71%（w/w） ； 淀 粉
15、变 为 葡 萄 糖 （C6H10O5）n+nH2O=nCeHOJ的理论转化率为：111.11%（w/w）；葡萄糖转化为 乙醇的理论转化率为：51.1%;酒精在20oC的密度为：0.789 g/L。实验具体步骤：2012.5.18 周五早上仪器、试剂的准备1、仪器准备和灭菌（17个500mL三角瓶、17个发酵栓、3个100mL量筒、2个10mL移液管、2 条玻璃棒、2 个大口盅、4 个过滤膜、1 个过滤枪、2 个烧杯 ）（均要灭菌 处理）2、溶液及试剂配制：1）2.5g/L标准葡萄糖溶液：称取105C左右烘干至恒重的葡萄糖2.5g，加水溶解，蒸馏水定容至 1000mL。2）菲林甲液：称取34.65g硫酸铜加蒸馏水定容至500mL。3）菲林乙液：称取173g酒石酸钾钠+50g氢氧化钠，加蒸馏水定容至500mL。（各组自配）4）
