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1、资料内容仅供您学习参考.如有不当之处诘联系改正或者删除质粒构建流程质粒构建流程一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位 点，即为可用没切位点。3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如pcDNA3.1（+）,4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者 共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用 酶切位点。5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱 基。6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，
2、将对应片段添加到设 计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。7）引物设计完成，送公司合成。二、目的片段获取1. RNA提取试剂盒：Bioteke高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL4C、漂洗液RW -20C。保存）准备：冰盒、4C。预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA-套操作步骤：1）将1000卩1裂解液RL加入细胞中，混合5mino2）加200卩1氯仿混合，震荡15s,室温孵育3min。3）4C, 12000rpm 离心 10mine4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550pl）5）加入1倍体积（550卩1） 70%乙醇,混匀6）全部转移到套收集管的吸附柱RA
3、中，4C, lOOOOrpm离心45s7）弃废液,重套收集管，加500pl去蛋白液RE, 12000rpm离心45s8）弃废液，重套收集管，加700卩1去漂洗液RW, I2000rpm离心60s9）弃废液，重套收集管，加500卩1去漂洗液RW, 12000rpm离心60s10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min11）吸附柱放入新EP管，加50pl RNase free water于膜上，室温放置2min12）4C, 12000rpm 离心 60s13）点样:5pl RNA+ lpl 1 Ox buffer, 1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V, 3min,可见 3条亮带。14）-2
4、0C保存2. RNA反转录试剂盒:TaKaRa primescript RT reagent kit with gDNA eraser （-20C0保存）准备：冰盒，取出解冻，为酶不可取出，预冷离心管操作步骤:1）基因组DNA去除（10pl体系） 5xgDNA eraser buffer 2卩1 gDNA eraser1 plTotal RNA4pl（可根据RNA浓度调整） RNase free water3口1PCR 仪中进行,程序：42C, 2min-4C注：RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入2）反转录反应（20卩1体系） 5 x primerScript buffer
5、24卩1 primerScript RT enzyme mix I lpl RT primer mix RNase free water1）反应液1川4卩1iomPCR 仪：37C, 15min-85C, 5s-4C注：可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液中3）1.5mlEP管收集20C长期保存3. PCR扩增高保真酶primerstar扩増，50曲PCR程序:dNTP4川95C5mindH2O32.5jil95 C30sPrimers tar0.5plcDNA1卩1（可变）厂 X5xPS buffer 10j.ilR-primerF-primer1 口1 点样：5plPCR 产物 +
6、 1M1 6xbuffer, 1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V, 15min 4. PCR产物纯化1）液相纯化（产物电泳结果只含目的条带）试剂盒:Microelute cycle-pure spin protocol（OMEGA bio-tek） D6293-01将PCR产物加入1.5mlEP管.加入5倍体积buffer CP?混匀。资料内容仅供您学习参考.如有不当之处话联系改正或者删除#资料内容仅供您学习参考.如有不当之处请联系改正或者删除 转移至HiBind MicroElution DNA柱（套收集管），室温离心lOOOOg,lmino 弃废液，力n 7001 DNA wash buff
7、er （含乙醇）到柱子，室温离心10000g,lmino 弃废液，重复 弃废液，空管离心13000g, lmin 柱子放入新EP管，加10-20pl Elution buffer到膜上，室温孵育3-5min,离心lOOOOg, 1 min 电泳检测2）割胶回收（产物电泳结果含杂带） 将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5ml EP管。 加等体积（lg=lml） binding buffer （XP2） ,60C。金属浴7min左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min 溶液加入离心柱，离心lOOOOg, lmin,废液倒回再离一次 弃废液，力n 300pl binding bu
8、ffer （XP2）,离心 lOOOOg, lmin 弃废液，加 700j.il SPW washing buffer,离心 lOOOOg, 1 min 重复 空管离心13000g, 2min,弃废液，柱子转移到新EP管 加入 30-50j.il elution buffer于膜上,室温孵育 lmin,离心 13000g, lmin 电泳检测30pl反应体系如下：三、双酶切Vector12pl10xM/L/K buffer3卩13dH2O13卩1资料内容仅供您学习参考.资料内容仅供您学习参考.如有不当之处诘联系改正或者删除PCR纯化产物15pllOxM/L/K buffer 3卩13dH2O1
9、0卩1酶A1卩1酶bmi反应条件：takara酶30C。水浴lh65C。金属浴10min终止反应注：buffer类别依使用的酶具体选择，见附表四、连接1）双酶切后，可将质粒酶切产物琼脂糖电泳1-2卩12）酶切产物液相纯化PCR产物 63卩13）20皿连接体系（皆可）pcDNA3l 0.7plPCR产物 5卩110xT4buffer 2plpcDNA3.1 2卩110xT4buffer 2卩1T4 ligase 1 pl3dH2O 10山PCR仪中进行:22C, 30注：连接产物-20C。可长期保存五、转化准备：碎冰，灭菌EP管、LB空液体培养基，带抗性培养板，超净工作台，移 液枪，水浴锅加热4
10、2C。1）将感受态细胞置于冰上，待其融化2）超净工作台中，将连接产物10卩1加入100卩1感受态细胞，或质粒1-3卩1加入 lOOpl感受态细胞3）轻混匀，冰浴30min4）热击水浴42C, 45s,冰浴lmin5）加 9OOplLB 空培养基，摇菌 150rpm, 37C, lh6）浓缩离心13000rpm, lmin,上清液留约200pl重悬菌体，部分涂板（50-100卩1 ）7）完全吸收后，37C。倒置培养12-16h六、菌落PCR1）以rTaq酶50卩1体系配制PCR =宀注 后入，厂“型壮/+次知下：3dH2O35.7jilPCR程序：1 Ox buffer5 pl95 C5minM
11、eC123pldNTP4pl95 C30srTaq0.3plCOamR-primerlplF-primerU12）灭菌牙签挑单菌落放入PCR体系中搅一下，再在新板划板（注意编号） 每板挑10个菌。新划的板37C。倒置培养12-16ho3）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，记录含目的条带的菌落号备用。七、测序1摇菌1）PCR检测有目的条带的菌落，挑选2-3个较好的以供摇菌2）三角瓶中分装10ml LB抗性液体培养基3）用10卩1枪头挑起选择的菌落打到培养基中4）37CO 250rpm 摇菌 12-16h2. 送样每瓶取lml箧液，送华大基因测序3. 比对将测序结果与基因序列进行比对，比对正确则构建成
12、功，比对错误则重新构 建。（注：数据库中基因序列可能有误，若出现少数突变，可换其他数据库比对试试）八、菌种保存菌种比对成功，则可保存菌种备用。1）超净工作台中取1 -5mlEP管，加200J11 80%灭菌甘油。2）再加入800卩1菌液，轻混匀。3）液氮冻存。（一个基因冻2管即可）九、质粒提取菌种比对成功，冻存菌种后，箧液用于提取质粒。试剂盒:AXYGEN axyprep plasmid miniprep kit 250-prep操作步骤：1）取3-5ml菌液，室温下离心10000g, 1 min2）弃上清，加250pl solution 1/ RNase A重悬菌落，混匀3）加250pl s
13、olution II,倒置轻混匀，孵育2min。（整个裂解反应不超过5 min）4）加入250j.il solution III,立即倒置混匀,直到生成白色絮状沉淀。5）室温离心 13000g, lOmin6）上清液小心转入HiBind miniprep column（有套管），室温离心lOOOOg, lmin7）弃废液，力fl 500pl buffer HB,室温离心 10000g, 1 min8）选择性步骤：重复第7步9）弃废液,空管室温离心13000g; 2min10）柱子转入新EP管，加3O-5OPl elution buffer或3dH2O到膜上，室温孵育1- 2min11）室温离心
14、 13000g, 1 min12）提取的质粒-20C。保存备用资料内容仅供您学习参考.如有不当之处话联系改正或者删除#附：感受态制备方法（皆采用LB空白培养基）：1. 菌种活化1）用接种环直接取冻存的E.coli/ DH5a菌种，在LB平板上划线，37C。倒置培养16h2）挑单菌落转到2-10ml LB液体培养基中,摇菌37C, 250rpm, 12-16h3）取1ml菌液加入到100ml LB液体培养基，摇菌37C, 250rpm, 3h4）检测菌液 OD6（x） 0.5 （0.3-0.4）2. 感受态制备准备:O.lMCaCb灭菌,50ml离心管灭菌,冰水,1.5ml离心管冰上预冷,离心机4C。预冷。步骤：1）将菌液用50ml离心管分装，调平，4C离心3000rpm, 8min2）弃上清，O.lMCaChlOml重悬（冰水中进行，动作轻）,两管合成一管3）冰上放置一段时间,4C。离心2500rpm, 8min4）弃上清，0.1 M CaCl2 10ml重悬，4C。冰箱过夜沉淀5）上清液取出8ml,剩2ml,加670卩1 80%甘油（菌液：80%甘油=3:1）,轻混
