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1、实验一 培养基的制作及灭菌 （4学时P78104）一、实验目的 明确培养基的配制原理；掌握细菌和真菌培养基的制备方法和步骤。二、实验原理 1、培养基牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基，由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏，蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。在配方中不加琼脂时称之为肉汤培养基，常用于
2、扩大培养；加入琼脂配制的固体培养基一般用于细菌的分离培养、测数等。马铃薯蔗糖培养基是一种半合成培养基，常用于培养多种真菌，如酵母、霉菌和蕈菌（食用菌）等。 2、灭菌 灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称为灭菌。分干热和湿热灭菌。一般培养基使用高压蒸汽灭菌，0.1MPa，灭菌1530min。P100103 消毒：用较温和的物理或化学方法杀死病原微生物和有害微生物等绝大多数微生物，即部分灭菌。三、主要实验器材1、药品和试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、10 %NaOH溶液、10 %盐酸溶液；新鲜马铃薯、蔗糖（葡萄糖）。2、器材：小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙
3、、1000 mL刻度搪瓷杯、玻棒、pH试纸、试管、分装漏斗、棉花、棉线；天平、小刀、纱布、试管、菜板；高压蒸汽灭菌锅。四、实验掌握要点试管、三角瓶的包扎；培养基的分装；灭菌参数。五、实验内容与操作：（一）培养基配方1、牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏 5.0 g， 蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂 20 g，水1 000 mL，pH 7.0 。2、马铃薯蔗糖培养基的配制（P214） 去皮马铃薯小块 200 g，蔗糖（或葡萄糖） 20 g，琼脂 20 g，水1 000 mL，pH自然。（二）操作步骤 分四组：一、二组分别做牛膏斜面和三角瓶，三、四组做马铃薯的斜面和三角瓶。 1、配制牛肉膏
4、蛋白胨培养基操作步骤（1）按配方称取药品，加入盛有500 mL水的铝锅中，加热溶解药品。（2）再加入洗净的琼脂条（粉），搅拌、加热至琼脂完全熔化，补足水量至1 000 mL。（3）用玻棒沾少许溶液，测定pH值，用NaOH或HCl调节pH至7.0。（4）用分装漏斗装入18 mm180 mm试管（68 mL）中，塞好棉塞，用报纸或牛皮纸包扎棉塞部分，直立装入试管篓中，放入高压灭菌锅内，于121 ，0.1 MPa，灭菌30 min。 （5） 灭菌后，趁热摆放斜面。冷却后，于37 培养24 h做无菌检测。2、配制马铃薯蔗糖培养基操作步骤（1）马铃薯去皮，称取200 g，切成1 cm小方块，置入小铝锅中
5、，加1 000 mL水，置电炉上煮沸20 min，用双层纱布过滤。将滤液补水至1 000 mL煮沸。（2）加入蔗糖、洗净的琼脂条（粉），搅拌、加热至琼脂完全熔化，再补足水量至1 000 mL。（3）分装、灭菌、摆放斜面，操作同上。六、作业与思考题1、培养细菌常用的培养基？什么肉汤培养基？2、培养真菌的常用培养基？实验二 显微镜的使用及蓝细菌和酵母菌的形态观察（4学时p135，47，53）一、实验目的熟练掌握光学显微镜使用方法，利用水浸片法观察酵母菌、蓝细菌的形态特征。二、实验原理 1、普通光学显微镜的构造、成像原理、性能及使用方法P19 2、蓝细菌P47是光能营养菌，广泛分布于自然界中，在极端
6、环境中也能生长。部分蓝细菌还具有固定空气中氮素的能力，一些蓝细菌还能与真菌、苔藓、蕨类和种子植物共生，如念珠藻与真菌共生形成地衣（地木耳）。最简单的蓝细菌为杆状或球形的单细胞生物，多数则形成不分枝的丝状体，由许多单个细胞联成一串，并为一共同的胶质鞘套包被。蓝细菌主要进行分裂繁殖，单细胞蓝细菌分裂后形成群体，包围在胶质层内。丝状蓝细菌细胞在鞘内排成行，通过细胞分裂使菌丝加长，菌丝不分枝，但有时有假分枝。某些丝状蓝细菌能在丝状体中间或顶部产生异形胞，异形胞比营养体稍大，壁厚，两端有极节，只含有叶绿素a，是固氮蓝细菌固氮的场所。另一些蓝细菌可形成由营养细胞膨大、细胞壁加厚的厚垣孢子。在不良环境下，厚
7、垣孢子可处于休眠状态，待环境适宜时，孢子再萌发成新菌丝。3、酵母菌课本4851 呈球状、卵圆状、椭圆状、柱状和香肠状，无性繁殖多营出牙方式。最典型和最重要的酵母菌为酿酒酵母，形态：球状、卵圆状或椭圆状。三、实验器材1、菌种：干地衣；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面菌种。2、器材：克氏培养基或麦氏培养基的试管斜面，载玻片、盖玻片、接种环、蒸馏水、滴管和显微镜。四、实验掌握要点1、显微镜的基本结构、原理、性能及使用方法。2、无菌操作技术。3、水浸片的制作。五、实验内容与操作：（一）实验内容1、显微镜的使用 2、蓝细菌的形态观察 3、酵母菌的形态观察（二）操作步骤1、
8、显微镜的使用：先在低倍（10倍）下找到视野，再换高倍镜（40倍）观察，最后用油镜进一步观察绘图。使用完毕，用擦镜纸将油镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸少许二甲苯将镜头擦23次，最后将擦镜纸将镜头擦23次，将显微镜归还原处。2、蓝细菌的形态观察操作步骤（1）将干地衣用水浸泡24 h，取菌液一滴，加入洁净载玻片上，盖上盖玻片。（2）镜检：先低倍、后高倍镜观察。3、酵母菌的形态观察操作步骤（1）酵母菌的培养：将酿酒酵母转接到马铃薯培养基斜面上，28培养2天。（2）制片与观察：加一滴蒸馏水于载玻片中央，挑取酵母菌培养体少许放入水滴中制成涂匀，盖上盖玻片。在显微镜下镜检，先低倍镜，后高倍镜。六、作业与思考题
9、1、绘出所观察到的蓝细菌的形态图，标明营养细胞和异形胞。2、绘出所观察到的酵母菌的形态图，注明各部位的名称。实验三 革兰氏（G）染色和细菌运动性观察（4学时p3840，4647）一、实验目的学习微生物涂片、革兰氏染色的基本技术，掌握细菌的革兰氏染色方法；初步认识细菌的形态特征；了解细菌运动性观察方法。二、实验原理革兰氏染色原理见p38。革兰氏染色法能将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，是世界上最常用的鉴别染色法。细菌运动性观察原理P46：细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定的重要特征之一。鞭毛是细菌的运动器官，可采用悬滴法或水封片法（即压滴法）直接在光学显微镜下检查细菌是否具有运动能
10、力，以此来判断细菌是否具有鞭毛。悬滴法：将菌液滴加在洁净的盖玻片中央，在其周边涂上凡士林，并倒盖在有凹槽的载玻片中央，放置光学显微镜下观察。水封片法：将菌液滴加在普通载玻片上，盖上盖玻片，置显微镜下观察。大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有的有鞭毛，如枯草芽孢杆菌；有的无鞭毛，弧菌和螺旋菌几乎都有鞭毛。有鞭毛的细菌在幼龄时具有较强的运动性，衰老的细胞鞭毛易脱落，故观察时宜选用幼龄菌体。三、主要实验器材1、活材料：培养16 18 h的金黄色葡萄球菌，培养24 h的大肠杆菌；培养1216 h的枯草杆菌。2、染色液和试剂：结晶紫、碘液、95 %酒精、番红、香柏油、二甲苯、凡士林。3、器材：废液缸、洗瓶、载玻
11、片、盖玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、显微镜。四、实验掌握要点（1）革兰氏染色菌龄控制在1824 h，细菌运动性观察菌龄控制在1216 h。（2）染色时间和原理（3）细菌运动性的判断五、实验内容与操作：（一）实验内容1、细菌的革兰氏染色法P39402、细菌的运动性观察p4647（二）操作步骤1、细菌的革兰氏染色操作步骤（1）涂片：用记号笔在一洁净的载玻片上的左右两端标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片、干燥、固定。（2）初染：在水平位置上，将草酸铵结晶紫染液滴加在涂片上，染色1 min，倾去染液，用流水冲洗至流下水呈无色为止。（3）媒染：用新配的卢哥氏碘液冲去涂面
12、上的残水，再将涂面覆盖染色1 min，水洗。（4）脱色：载玻片反面衬一白纸，手执载玻片使之倾斜，滴加95 %乙醇进行脱色，当载玻片上流出的乙醇液中紫色接近消失时（2030 s）立即用自来水冲洗。（5）复染：去掉载玻片上的水珠，在涂面上滴加番红染色液，染色35 min，水洗，吸水纸吸干。（6）镜检：用油镜观察革兰氏染色后的菌体形态及颜色。2、细菌的运动性观察水封片法 （1）滴加菌液：滴加一滴菌液于洁净的载玻片上，盖上盖玻片，用记号笔在菌液的边缘做一记号，以便在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。（2）镜检：先用低倍镜找到标记，再稍微移动即可找到菌液的边缘，将菌液移到视野中央换高倍镜观察。由于菌体是
13、透明的，镜检时可适当缩小光圈或降低聚光器以增大反差，便于观察细菌的运动性。细菌的运动：从一处游动至它处，可看到活跃的运动；布朗运动：仅在原处左右摆动。六、作业与思考题1、革兰氏染色中哪一步是关键？为什么？你如何控制这一步？2、绘出革兰氏染色的菌体形态图，并注明菌体颜色及反应性（阳性或阴性）。3、绘出所看到的细菌的形态图，并用箭头表示其运动方向。4、镜检时如何区别由鞭毛引起的细菌运动和布朗运动？实验四 霉菌与放线菌的形态特征观察（4学时p5152、50）一、实验目的学习自制水浸片观察霉菌、放线菌的形态，了解几类常见霉菌、放线菌的基本形态特征。二、实验原理霉菌营养体是分枝的丝状体。分基内菌丝和气生
14、菌丝。气生菌丝中有可分化出繁殖菌丝，不同的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝)及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，故制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片的特点是：细胞不变形，具有杀菌防腐作用，且不宜干燥，能保持较长时间，溶液本身呈蓝色，有一定的染色效果。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多(约为310微米)，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。放线菌的孢子丝形状和孢子排列情况是放线菌分类的重要依据，为了不打乱孢子的排列情况，常用印片法进行制片观察。三、实验器材1、
15、活材料：在马铃薯培养基上生长34天的根霉、青霉和米曲霉；在高氏一号培养基上生长的放线菌。2、染色液和试剂：乳酸石炭酸棉蓝染色液、50 %酒精；石炭酸复红染色液。3、器材：剪刀、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、酒精灯、显微镜。四、实验掌握要点1、霉菌的水浸片制作2、放线菌的印片染色法五、实验内容与操作：（一）实验内容1、霉菌的形态观察（低倍镜）P5152。2、放线菌的形态观察（油镜）P50。（二）操作步骤1、霉菌水浸片制作的操作步骤（1）制片：在载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液或蒸馏水，用解剖针从平板上挑取少量带孢子的霉菌菌丝，用50 %的乙醇浸润，再用蒸馏水将浸过的菌丝洗一下，然后放入载玻片的液滴中，用解剖针将菌丝分散开来。盖上盖玻片。（2）镜检：先用低倍镜，必要时转换高倍镜镜检，注意观察菌丝有无隔膜，有无假根、足细胞等特殊形态的菌丝及无性繁殖器官的性状、构造、孢子着生的方式、孢子的形态大小，并记录观察结果。2、放线菌印片染色的操作步骤（1）制片：用小刀窃取放线菌培养体一块（带培养基），放入洁净载玻片上，用另一载玻片对准菌块的气生菌丝轻轻按压，
