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1、降脂评价模型建立的研究进展摘要：高通量降血脂活性成分筛选为高脂血症治疗药物和保健品开发提供了便捷通道。本文简述动物模型的建立，并从胆固醇代谢筛选模型、模拟胆汁胶束法和脂质代谢调控酶的抑制剂方面，对近年来国内外降血脂成分体外筛选方法进行了介绍，为降血脂活性成分的筛选研究提供参考。关键词：高血脂；降血脂；动物模型；体外模型高脂血症主要是指血清总胆固醇（TC）或甘油三酯（TG）水平过高和（或）血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平过低。高脂血症所引起的动脉粥样硬化是造成冠心病、高血压和脑血管疾病的主要原因，全球每年约有1200万人死于心血管病和脑中风。所以，血脂异常的预防与治疗工作显得尤为重要。当
2、前，主要采用药物治疗与非药物治疗相结合的方式。膳食补充、干预是高脂血症治疗中的基础治疗。以传统中草药或提取物、普通食品浓缩物及新兴的多肽蛋白类为主，研发多种新型功能性食品，通过膳食补充的方式进行高脂血症。本文就合理高效的评价模型的建立即有效成分的筛选进行综述。1降血脂动物模型1-3采用高脂饲料喂养法，观察小鼠进食高脂饲料60d内血脂变化情况，从而评价高血脂小鼠模型在60d内的稳定性。将大鼠与小鼠在同一时间，相同的实验条件下，进行降血脂功能检测实验，观察两种保健食品对高血脂小鼠和高血脂大鼠血脂各项指标的影响。通过动物实验，对喂食高脂食料的小鼠进行不同膳食纤维降血脂功能比较，通过测定TC、AI等指
3、标进行研究发现，可溶性膳食纤维在降血脂方面有着显著效果。2降血脂体外评价模型目前为止，降血脂的评价方法主要采用降血脂动物模型，动物模型虽然更能够模拟人类高血脂的情况，但是周期长、花费大，不适合化合物的广泛筛选。因此建立一种高血脂细胞体外评价技术，快速筛选、研究和开发具有降低高脂血症的功能因子非常重要。2.1 胆固醇代谢筛选模型2.1.1 降低细胞中胆固醇含量细胞内胆固醇的流出对维持细胞胆固醇平衡、促进胆固醇逆转运及抗动脉粥样硬化都起着非常重要的用。以血管平滑肌细胞源性荷脂细胞为模型，不同浓度及时间姜黄素处理细胞，高效液相色谱分析法检测细胞内总胆固醇4。结果表明，姜黄素可降低胞内总胆固醇、游离胆
4、固醇和胆固醇酯含量，且这种作用跟固醇调节元件结合蛋白的表达上调有一定关系。以3T3-L1脂肪细胞为模型5，给予不同浓度的烟酸干预后，收集细胞，采用液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出。结果表明，烟酸可加速细胞内胆固醇流出，降低细胞内胆固醇含量。张露等6研究了银杏叶提取物GBE50对培养细胞内胆固醇代谢的影响，采用胆固醇氧化酶终点法检测GBE50对培养细胞HepG2、HUVEC、SH-SY5Y总胆固醇含量的影响。结果表明，GBE50 可有效降低部分培养细胞内总胆固醇的含量。2.1.2 阻止胆固醇的吸收Caco-2细胞模型已经成为一种预测药物人体小肠吸收以及研究药物转运机制的标准体外筛选工具。体外人
5、结肠腺癌(Caco-2)细胞系法，可应用于多类药物研究，帮助了解药物的吸收机制，预测体内吸收和药物相互作用，研究药物的小肠代谢情况，从而促进新药研发。向处于对数生长期的Caco-2细胞添加含有药物和14C同位素标记的胆固醇胶束溶液，共培养后裂解细胞，放射定量检测细胞中胆固醇的含量；计算加药物处理与未处理细胞中胆固醇含量的比值。Nagaoka 等7报道了-乳球蛋白肽对Caco-2 细胞胆固醇吸收的影响，胰蛋白酶水解后的-乳球蛋白多肽Ile-Ile-Ala-Glu-Lys可以明显降低Caco-2 细胞对胆固醇的吸收。van Heek等8发现Ezetimibe可以选择性的抑制小肠上皮细胞对于胆固醇的
6、吸收。2.2 模拟胆汁胶束法2.2.1 胆汁酸结合肠道中的胆汁酸经过内部循环，阻断肝胆循环，结合胆汁可使肝脏中的胆固醇减少。胆汁酸结合能力测定：适量样品溶于牛磺胆酸盐缓冲溶液，振荡摇匀后37孵育9，然后室温下透析，检测透析液中牛磺胆酸盐的含量，计算样品胆汁结合能力。考来烯胺(消胆胺)和考来替泊(降胆宁)为碱性阴离子交换树脂，在肠道与胆汁酸形成络合物随粪排出，故能阻断胆汁酸的重吸收，影响胆固醇吸收。因此具有胆汁酸结合能力的物质，具有一定的降血脂活性。2.2.2 胆固醇吸收抑制胆固醇只有溶于混合胶束，才会被运至小肠绒毛进行吸收，因此其溶于胶束是胆固醇吸收的关键。植物甾醇、活性多肽、活性多糖类物质能
7、降低胆固醇在油相和胶束相中的溶解度，与胆固醇竞争进入胆盐胶束，竞争混合胶束的空间并取代胆固醇，干扰其吸收。体外模拟人体的肠道，用超声波乳化的方法制备出一种人造胆汁胶束溶液。此方法可以对这类降血脂活性物质进行筛选。Nagaoka等10从-乳球蛋白水解产物中分离纯化得到了第一条降血脂多肽(IIAEK)。Zhong等11先后采用此方法进行了大豆降胆固醇活性肽的分离纯化，并分离到了具有显著降低胆固醇活性肽组分Try-Gly-Ala-Pro-Ser-Leu。此法不足之处是样品需要量在毫克级，不利于高通量筛选方法的建立。2.3 脂质代谢调控酶的抑制剂研究较多的参与脂质代谢的酶与蛋白质主要有脂蛋白脂肪酶、肝
8、脂酶、卵磷脂胆固醇酰基转移酶、3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶、胆固醇酯转移蛋白等。2.3.1 HMG-CoA还原酶抑制剂HMG-CoA还原酶是体内催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)生成二羟甲基戊酸(MVA)的关键酶，这一步是体内合成胆固醇的限速步骤，也是目前最主要的高血脂症临床药物的靶点。HMG-CoA 还原酶抑制剂是降血脂功效成分和药物筛选主要手段之一。目前，抑制剂对HMG-CoA还原酶抑制活性的研究方法主要有：1)分光光度法。从猪肝中提取HMG-CoA还原酶，以NADPH、Cysteamine为底物，于波长339nm处测定NADPH 光吸收
9、的下降可代表酶活力大小及反应速度。但是此法反应条件难以控制，背景干扰无法去除，会造成测定结果的不准确；2)同位素标记法。如以14C-乙酸、D,L-14CHMG-CoA或D,L14C-甲羟戊酸作为底物，反应后测定形成的固醇中同位素的掺入率，可计算出样品抑制固醇脂质合成能力12。方法简便、不需分离步骤，且灵敏度高，定位定量准确，但对实验人员要求较高；3)薄层层析法。胡海峰等13建立了体外酶反应系统，以HMG-CoA还原酶抑制剂美伐他汀为阳性对照，使用TLC 分析胆固醇合成量，筛选真菌次级代谢产物。其他分离方法如纸层析法和柱层析法，同样可以有效地将底物与产物分离；4)液相色谱法。通过检测反应体系中N
10、ADPH浓度的变化，测定HMG-CoA还原酶抑制剂活性14。不过由于反应体系只有100L，容易引起操作误差。另外，人们已从微生物代谢产物中发现了角鲨烯合成酶抑制剂，不仅能降低血浆胆固醇水平，还能降低血浆甘油三酯水平15，而且对类异戊二烯的合成没有影响。角鲨烯合成酶抑制剂的研究也已成为降血脂药物研制的一个重要方向。2.3.2 脂肪分解与合成酶抑制剂2.3.2.1 脂肪酶抑制剂脂肪酶抑制剂筛选已成为降血脂和减肥药物筛选的重要方向。脂肪酶抑制剂筛选过程中酶活测定方法和脂肪酶、底物的选择都非常重要。稳定的脂肪酶活性测定方法是其抑制剂筛选的关键。目前，脂肪酶活性测定的方法很多，尚无统一标准。常用的脂肪酶
11、水解底物有1,2-二月桂基-rac-丙三氧基-3-戊二酸试灵酯、对硝基苯酚棕榈酸酯、三油酸甘油酯、橄榄油，以及其他油类如苏籽油、亚麻油、鱼油、月见草油等。Umezawa等16从Streptomyces lavendulae MD4-Cl的发酵液中纯化得到了一种强效胰酯酶抑制剂esterastin，其IC50为0.36mol/L。Weibel等17从Streptomyces toxytricini分离到了胰脂酶抑制剂lipstatin，其IC50为0.14mol/L，对其他的胰酶如磷脂酶A2和胰蛋白酶活性基本没有影响。罗氏公司又将Lips tatin氢化还原衍生为更稳定的orlistat，并被F
12、DA 批准为抗肥胖药。临床研究表明orlistat具有显著的降血脂和减肥效果18，它们的作用机制为通过与胃、胰脂肪酶活性部位的丝氨酸残基共价结合而使其失活，抑制甘油三酯水解，并使单甘酯和游离脂肪酸的摄入减少。Takahashi19申报了脱脂大米胚芽中提取脂肪酶抑制剂的美国专利。2.3.2.2 脂肪酸合成酶(FAS)抑制剂脂肪酸合成酶为维持食物摄入和能量消耗之间合适的平衡点提供了很好的调节靶位。浅蓝菌素(cerulenin)作为第一个脂肪酸合成酶抑制剂，可以与脂肪酶共价结合形成复合物，是FAS的非竞争性抑制剂。Loftus等20以浅蓝菌素为模板合成了C75，腹腔注射C75(15mg/kg)对内源
13、性脂肪酸合成酶抑制率达95%，丙二酰辅酶A浓度增加了110%。在外周，它可以增加CPT-1 活性，通过加速脂肪酸的氧化来加快能量消耗进程。绿茶中表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)也对FAS有抑制作用。2.3.2.3 酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶(ACAT)抑制剂酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶(ACAT)抑制剂可抑制体内小肠、肝脏及动脉的ACAT，降低血浆总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇水平，同时阻止胆固醇酯化，减少胆固醇在动脉壁的蓄积，防止动脉粥样硬化的形成及发展。ACAT对胆固醇的吸收、VLDL的形成及胆固醇在动脉粥样硬化病变中的蓄积起着关键性作用。从20世纪80年代后期已开始从微生物代谢产物中
14、筛选ACAT抑制剂，其研究主要集中在日本，产生菌有青霉、烟曲霉、粘帚霉、镰孢霉等。微粒体ACAT 活性的测定21，应用14C 标记的游离胆固醇，以大鼠肝微粒体作为酶的来源。测定油酸转化成它的CoA酯及随后酯化成游离胆固醇过程中两个酶学反应的产物活性。Tomoda等22从Pencillium purpurgenum的代谢产物中发现ACAT抑制剂。Fukuda等23从苦丁茶中分离到单萜苷类化合物活性较高，IC50为0.269mol/L。Nishimura等24分离到三萜类化合物，其ACAT抑制活性很强，IC50为0.044mol/L。2.3.2.4 胆固醇代谢调控关键蛋白抑制剂Cao等25研究组报
15、道了调节胆固醇代谢的新机制，发现新的胆固醇代谢调控关键蛋白-gp78 结合蛋白Ufd1，并发现Ufd1蛋白与gp78蛋白的结合增强了gp78的泛素连接酶活性，加速胆固醇合成代谢的关键酶-羟甲基戊二酰辅酶A 还原酶的降解，进而增强细胞对低密度脂蛋白的吸收，降低血液胆固醇水平。Altmann等26通过染色体生物信息系统证实了药物的分子学机制，其作用靶点是胆固醇吸收蛋白(Niemann Pick C1 like1，NPC1L1)，其氨基酸结构有42%与Niemann Pick C1型蛋白 (NPC1)相同。胆固醇吸收蛋白目前已被证实为胆固醇浓度最主要的调节因子27，机制可能是通过细胞核的胆固醇感受器
16、LXR，其在调节细胞内胆固醇、脂肪酸、葡萄糖的动态平衡中发挥了重要作用，主要表达在肝脏、小肠、肾脏、脂肪等器官和组织28。Ge 等29报道了在肝脏和小肠细胞中，NPC1L1控制胆固醇在细胞表面和细胞内循环转运，并鉴定出这个过程依赖于细胞内的微丝系统和Clathrin/AP2蛋白复合体。他们进一步阐明了新近上市的降胆固醇药物Ezetimibe 的作用机制，证明该药物通过抑制NPC1L1蛋白，从而抑制细胞对胆固醇的吸收。这些研究都为寻找更加有效的新型降胆固醇药物提供了靶点和研究基础。另外微粒体甘油三酯(MTP)抑制剂和固醇断裂活化蛋白(SCAP)配体的研究也在进行中。胆固醇酯转运蛋白(CETP)是胆固醇逆向转运过程中的关键酶之一。在CETP介导下，HDL中的胆固醇酯与LDL和VLDL的TG相互交换，调节血浆HDL水平、
