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1、人总胆固醇（TC）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，组织及相关液体样本中总胆固醇（TC ）的含量。实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人总胆固醇（TC）水平。用纯化的人总胆固醇（TC）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入总胆固醇（TC）， 再与HRP标记的总胆固醇（TC）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗 涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终 的黄色。颜色的深浅和样品中的总胆固醇（TC）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定 吸光度（OD值），通
2、过标准曲线计算样品中人总胆固醇（TC）浓度。试剂盒组成:试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2 片(48)2 片(96)密封袋1个1个酶标包被板1X481X962-8 C保存标准品：54nmol/ml0.5ml X 1 瓶0.5ml X 1 瓶2-8 C保存标准品稀释液1.5ml X1 瓶1.5ml X1 瓶2-8 C保存酶标试剂3 mlX1 瓶6 mlX 1 瓶2-8 C保存样品稀释液3 mlX1 瓶6 mlX 1 瓶2-8 C保存显色剂A液3 mlX1 瓶6 mlX 1 瓶2-8 C保存显色剂B液3 mlX1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存终止液3ml X 1 瓶6
3、ml X 1 瓶2-8 C保存浓缩洗涤液(20ml X 20 倍)X1 瓶(20ml X 30 倍)X1 瓶2-8 C保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。2血浆：应根据标本的要求选择EDTA、者柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后， 离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再 次离心。3尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中 如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液
4、参照实行。4细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/ 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓 度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟 左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS, PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备 用。标本融化后仍然保持2-8的温度。加入一定量的PBS （PH7.4）,用手工或匀浆器将 标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）
5、。仔细收集上清。分装后一份待检测， 其余冷冻备用。6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上 进行试验，可将标本放于-20C保存，但应避免反复冻融.7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标 准品100M，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50山，混匀；然后从第一孔、第二 孔中各取100M分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50山， 混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50卩1弃掉，再各取50M分别加到第五、第
6、六孔 中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各 取50M分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50M，混 匀后从第七、第八孔中分别取50卩l加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准 品稀释液50卩l，混匀后从第九第十孔中各取50卩l弃掉。（稀释后各孔加样量都为50卩1， 浓度分另U为 36nmol/ml, 24 nmol/ml ， 12nmol/ml, 6 nmol/ml, 3nmol/ml）。2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40卩
7、l,然后再加待测样品10卩l （样 品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混 匀。3. 温育：用封板膜封板后置37C温育30分钟。4. 配液：将30 （48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 （48T的20倍）倍稀释后备用。5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶标试剂50gl，空白孔除外。7. 温育：操作同3。8. 洗涤：操作同5。9. 显色：每孔先加入显色剂A50gl，再加入显色剂B50gl，轻轻震荡混匀，37C避光显色 15分钟.10. 终止：每孔加终止液50卩1，终止
8、反应（此时蓝色立转黄色）。11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。注意事项：1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未 用完，板条应装入密封袋中保存。2. 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3. 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好 控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值 大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀
9、释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计 算时请最后乘以总稀释倍数（XnX5）05. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6. 底物请避光保存。7. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准8. 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。9. 本试剂不同批号组分不得混用。10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标, 在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释 倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标 准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值 代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释 倍数，即为样品的实际浓度。（此图仅供参考）试剂盒性能：1. 样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。2.批内与批见应分别小于9%和15%检测范围：1 nmol/ml -45 nmol/ml保存条件及有效期：1试剂盒保存:2-8C。2. 有效期：6个月
