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1、毛果芸香提取物具有美白效应Jaborandi extract reveals whitening propertiesThierry Decharneux,Michel StratiCELL,France文献来源：published in January 2011 personal care翻译：吕晓滕摘要 在我们最近的研究中，我们通过2D和3D模型评估发现卡匹碱（一种从毛果芸香中提取的咪唑生物碱）对皮肤具有美白效果。 人体皮肤中的色素，包括黑色素的合成，是由黑色素细胞中的一系列酶催化的复杂的化学反应来完成的。黑色素在黑色体中合成，然后运输到树突状细胞的一端，在那里被转移到邻近的角质细胞。黑色
2、素的合成起始于L-Tyr转变为L-二羟基苯丙氨酸，然后在一种特殊的酶，酪氨酸酶的作用下继续氧化形成多巴醌还有一些其他的因子和多个基因参与了黑色素基因的表达调控。 在本研究中，我们利用鼠的B16色素细胞测试了卡匹碱对酪氨酸酶活性的影响及黑色素的含量。我们证明了卡匹碱能够显著的降低酪氨酸酶的活性。我们通过3D云细胞色素还原模型证明了我们的实验结果，这个模型允许角质细胞和黑色素细胞之间存在关联。 根据3D云细胞色素还原模型所得到的结果，运用基因芯片技术研究与皮肤色素合成有关的基因，发现卡匹碱是一种新型无毒的，能够调节皮肤色素合成途径的物质，并可以作为化妆品中的美白物质。芸香科植物广泛分布在巴西北部地
3、区，这个地区也因为毛果芸香而众所周知。毛果芸香的叶片中含有重要的咪唑生物碱，如毛果芸香碱，毛果芸香啶，卡匹碱等，其中有些成分的药理和生理特性仍然不清楚。我们从毛果芸香的叶片中提取出了卡匹碱和其他的一些咪唑生物碱。本研究中使用了2D和3D模型来评价了卡匹碱对皮肤美白的效果。黑色素产量的调节涉及众多的调节途径，而这些调节途径可以增加小眼畸形转录因子（MITF）的表达。通过磷酸化作用刺激酪氨酸激酶（TYR），酪氨酸激酶相关蛋白1（TYR1）和多巴色素互变异构酶（DCT）的转录来增加MITF的表达和活性，这些都是黑色素形成过程中的关键酶。酪氨酸酶也参与了L-Tyr氧化成为L-3-（3,4-二羟苯基）-
4、丙氨酸（L-DOPA）和DOPA氧化成为多巴醌的过程，这是黑色素合成过程中的起始步骤。多巴醌自发地转变成为多巴色素。多巴色素互变异构酶（DCT）催化多巴色素转变为5,6-二氢羟基吲哚-2-羧酸（DHICA）。酪氨酸酶1（TYR1）催化DHICA氧化为吲哚-5,6-醌-2-羧酸。这两种联系非常紧密的结构，DCT和TYR1，通过一些列的催化作用，产生了不稳定的醌类物质，然后经过进一步的聚合，最终形成黑色素。黑素原在黑色体内合成，这是一种能够加快黑色素生成的特殊细胞器。黑色体和黑色素细胞微管蛋白一起沿着运输网络运输，通过动力蛋白和纤动蛋白的作用，到达树突末端。黑色素细胞的树突，主要是由Rho家族蛋白
5、，这个蛋白家族与许多角质细胞都存在相互联系，并通过这种联系转移产生的黑色素。黑色素细胞转运黑色素的机制受凝集素，糖蛋白，E-钙粘蛋白，陷阱蛋白（SNAREs），Rab和Rho GTP酶之间的相互关系。在本研究中，我们测量了卡匹碱对小鼠黑色素B16细胞中酪氨酸酶活性以及黑色素含量的影响。卡匹碱的美白效果通过测定重构的人类表皮细胞中含有的黑色素细胞的基因表达水平来评估。在2D模型中，卡匹碱加入到小鼠B16黑素瘤细胞的培养基中，测定黑色素的含量和酪氨酸酶的活性，并与熊果苷（一种著名的脱色剂）和甲基异丁基黄嘌呤（IBMX）相比较，将它们当作色素沉积的参照（磷酸二氢酶抑制剂）。在3D模型中，我们利用晒成
6、深色的表皮来评估卡匹碱的美白作用，并通过生化与形态学比较的方法与酪氨酸激酶抑制剂曲酸和甲基异丁基黄嘌呤（IBMX）相比较。用黑色素溶剂提取组织中的黑色素进行丰塔纳马松染色，然后进行图形分析。并通过荧光定量PCR技术来分析参与黑色素原合成的基因，据估计卡匹碱能够影响超过90个的参与黑色素原形成的基因的表达。结果与讨论毒性评估与剂量探索 过去的研究表明，天然的或者人工合成的物质能够抑制黑色素合成的不在少数，但是他们之中只有很少的一部分能够开发成为美容产品，这是因为在这些物质的有效浓度下，他们同时也是有毒的。 为了测试卡匹碱用于皮肤美白的安全浓度，我们在培养好的黑色素细胞B16和重构的人表皮组织中加
7、入不同浓度的卡匹碱，并将它与对照组做对照。 在实验中，分别用浓度为0.005%，0.01%，和0.025%的卡匹碱对B16细胞做皮肤美白实验。用0.025%，0.05%和0.075%d的卡匹碱对重构人类表皮组织做皮肤美白实验。卡匹碱对肌肤美白的作用 将卡匹碱的美白作用，与熊果苷和曲酸的美白作用相对比，这两种物质常被皮肤科医生和美容师用来改善色素沉着过度紊乱的病人的肤色。酪氨酸激酶的活性与B16细胞中的色素含量检测 酪氨酸激酶参与色素合成速度的调控。在本研究中，用0.025%的卡匹碱先处理B16细胞，然后再检测细胞中酪氨酸激酶的活性和黑色素的含量，结果发现酪氨酸激酶的活性和黑色素的含量都出现了下
8、降（见图1a和图1b）。用0.025%的卡匹碱处理的B16细胞中酪氨酸激酶活性和黑色素含量下降的水平与用1uM的熊果苷相似。模式表皮MEL/001中黑色素的含量 我们也用无毒害作用剂量的卡匹碱测定了重构表皮中的黑色素含量，重构表皮由角质层细胞和黑色素细胞构成。 卡匹碱降低细胞中含色素含量的功能具有剂量依赖效应。在卡匹碱浓度为0.05%和0.075%的时候可以显著降低表皮中黑色素的含量。结果由丰塔纳马森染色证明（见图3）。模式表皮MEL/001中基因表达的研究 为了测定卡匹碱在人类色素表皮模型中抑制黑素原生成的分子机制，我们运用了特别定制的基因表达分析芯片测定了与黑色素合成相关的基因的表达。基因
9、表达的研究是通过用一定剂量的卡匹碱处理过的人类表皮细胞来完成的（卡匹碱在该剂量时能够降低黑色素含量但却没有毒副作用的）。 黑色素的合成发生在黑色体中，而黑色体的合成对于黑色素的合成具有决定性的作用。Rab蛋白比如说Rab32，他在黑色素合成过程中一种关键酶通过高尔基体的转运和黑色素体的成熟过程中起着重要的作用。受体蛋白和BLOC(溶酶体细胞器生物合成复合物)对固定于溶酶体相关的细胞器上的（比如黑素体）囊泡中的膜蛋白具有完善的排列机制。当前的研究表明用0.05%的卡匹碱处理重构的人类表皮可以降低HSP1的表达，当用0.075%的卡匹碱处理重构人类表皮时，它不仅能够降低HSP1的表达，并且还能够降
10、低AP1B1，AP3B1，BLOC1S1，和Rab32的表达，这说明卡匹碱能够影响黑素体的形成，当卡匹碱浓度为0.075%时还能降低SILV（）和MLANA（黑色素A，MART1）的表达，上述这些都与黑素体的形成发育有关。 APMC/PKA途径对于色素沉着的控制具有重要作用。这条途径由-MSH（刺激黑素细胞激素）与他特定的黑皮质素-1（MC1R）受体的结合激活。MC1R可以与G蛋白配对并可以激活腺苷酸环化酶（ADCY），可导致细胞内的AMPc浓度上升，最终激活蛋白激酶A。蛋白激酶A可以激活cAMP应激因子绑定蛋白1（CREB1），并通过激活MITF诱导黑素原生成，并可以上调黑素原合成酶类的表达
11、，比如TYR,TYRP1和DCT。0.075%的卡匹碱可以降低该途径中与卡匹碱功效有关的基因的表达，如MC1R，ADCY2，PKA和GEB1等。而0.05%和0.075%的卡匹碱能够降低MITF,TYR和TYRP1的表达。 而其他的可以激活MITF的途径与卡匹碱的激活途径相类似。KIT（干细胞因子受体）与黑素原细胞的增殖，分化等过程有关。现在已知激活KIT可以刺激分裂素激活蛋白激酶的产生并导致MITF的激活。用0.05%和0.075%的卡匹碱处理重构人表皮细胞的结果证明了KIT表达下降，用0.075%的卡匹碱处理时KIT配基也出现下降。 相关的内皮素-1（EDN-1）表达显著下降，卡匹碱对黑素
12、细胞的增殖与活力具有剂量依赖效应。END-1是由角质化细胞产生的，能够刺激酪氨酸的合成与邻近的黑素细胞生长。0.075%的卡匹碱能够降低位于黑素细胞的表面的内皮素受体（EDNRB）的活力。G蛋白配对受体能够激活蛋白激酶C途径，可以使细胞内的钙离子水平上升并促进黑素细胞的增殖和黑色素的产生。 黑色体从黑素细胞中转运到邻近的角质细胞中可能也受到卡匹碱的调节，当用卡匹碱处理重构的皮肤模型时，其CDH1，FGFR2和SNAP25的表达量都下降，FGFR2基因编码FGF蛋白受体，并允许黑色体通过吞噬的方式进行转运。SNAP25编码的蛋白能够促进囊泡膜与细胞膜之间的融合。 与细胞凋亡相关的基因（APAF-
13、1，BCL-2，BID和CASP3）和炎症反应相关的基因（IL-1，IL-1和TNF）也受到卡匹碱的调节，在卡匹碱浓度为0.05%至0.075%之间时，只有IL-1的表达量上升，其他的基因表达量都下降。 结论 在本研究中，我们测试了用黑色素合成抑制剂（卡匹碱）处理过的B16细胞和重构的3D人类表皮培养物的反应。结果显示卡匹碱能够降低重构的皮肤模型中的色素沉着的含量，并能够降低降低B16细胞中的酪氨酸激酶的活性和黑色素含量， 并且在用无毒剂量的卡匹碱处理的重构的人类表皮模型中，黑素原合成调节基因和黑色素含量都出现了明显的下降。 运用StratiCELL公司的基因表达分析芯片测定了与黑素原合成相关的基因，我们研究了卡匹碱降低色素沉着的机制。基因分析结果证明在大多数情况下卡匹碱的效果不仅仅是通过使MITF保持在表达水平以下来调节黑色素的产生，并且还能影响黑色素体的形成及其运输，黑素细胞树突的形成以及黑色素从黑色素细胞向周围角质细胞的转运。
