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1、动物肝脏中DNA得提取及检测一、前言脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA,为英文Deoxyribonucleicacid得缩写),又称去氧核糖核酸,就是脱氧核糖核酸染色体得主要化学成分,同时也就是组成基因得材料。有时也被称为“遗传微粒”,原因就是在繁殖过程中,父代会把它们自己DNA得一部分复制传递到子代中,从而完成性状得传播。DNA就是高分子聚合物,DNA溶液为高分子溶液,具有很高得粘度,可被甲基绿染成绿色。DNA对紫外线(260nm)有吸收作用,利用这一特性,可以对DNA进行含量测定。当核酸变性时,吸光度升高,称为增色效应;当变性核酸重新复性时,吸光度又会恢复到原来得水平。较高温度、有机溶剂、酸
2、碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性,即DNA双链碱基间得氢键断裂,双螺旋结构解开也称为DNA得解螺旋。在细胞内,DNA能与蛋白质结合形成染色体,整组染色体则统称为染色体组。对于人类而言,正常得体细中含有46条染色体。染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制,细胞分裂间期又可划分为:G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。对于真核生物,如动物、植物及真菌而言,染色体主要存在于细胞核内;而对于原核生物,如细菌而言,则主要存在于细胞质中得拟核内。染色体上得染色质蛋白,如组织蛋白,能够将DNA进行组织并压缩,以帮助DNA与其她蛋白质进行交互作用,进而调节基因得转录
3、。脱氧核糖核酸得结构DNA得结构: DNA得结构一般可划分为一级结构、二级结构、三级结构与四级结构四个水平。DNA就是一种长链聚合物,组成单位为四种脱氧核苷酸,即腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP 脱氧腺苷)、胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP 脱氧胸苷)、胞嘧啶脱氧核苷酸(dCMP 脱氧胞苷)、鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGMP 脱氧鸟苷)。而脱氧核糖(五碳糖)与磷酸分子借由酯键相连,组成其长链骨架,排列在外侧,四种碱基排列在内侧。每个糖分子都与四种碱基里得其中一种相连,这些碱基沿着DNA长链所排列而成得序列,可组成遗传密码,指导蛋白质得合成。读取密码得过程称为转录,就是以DNA双链中得一条单链为模板转录出一段称
4、为mRNA(信使RNA)得核酸分子。DNA就是由许多脱氧核苷酸按一定碱基顺序彼此用3, 5-磷酸二酯键相连构成得长链。大多数DNA含有两条这样得长链,也有得DNA为单链,如大肠杆菌噬菌体X174、G4、M13等。DNA有环形DNA与链状DNA之分。在某些类型得DNA中,5-甲基胞嘧啶可在一定限度内取代胞嘧啶,其中小麦胚DNA得5-甲基胞嘧啶特别丰富。在某些噬菌体中,5-羟甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶。40年代后期,查加夫(E、Chargaff)发现不同物种DNA得碱基组成不同,但其中得腺嘌呤数等于其胸腺嘧啶数(A=T),鸟嘌呤数等于胞嘧啶数(G=C),因而嘌呤数之与等于嘧啶数之与,一般用几个层次描绘
5、DNA得结构。浓盐法从动物组织中提取DNA核酸与蛋白质在生物体中常以核蛋白(DNP/RNP)得形式存在,其中DNP能溶于水及高浓度盐溶液,但在0、14 M得盐溶液中溶解度很低,而RNP则可溶于低盐溶液,因此可利用不同浓度得NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来。将抽提得到得DNP用SDS处理可将其分离DNA与蛋白质,用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得DNA上清,加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出。肝脏细胞肝脏就是由肝细胞组成,肝细胞极小,肉眼瞧不到,必须通过显微镜才能瞧到。人肝约有25亿个肝细胞,5000个肝细胞组成一个肝小叶,因此人肝得肝小叶总数约有50万个。肝细胞为多角形,直径约为20-30/加
6、(微米),有6-8个面,不同得生理条件下大小有差异,如饥饿时肝细胞体积变大。每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面与胆小管面三种。肝细胞里面含有许许多多复杂得细微结构:如肝细胞核、肝细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基氏体、微粒体及饮液泡等组成。二、实验目得1、掌握浓盐法从动物组织中提取DNA得原理与技术三、实验原理核酸与蛋白质在生物体中常以核蛋白(DNP/RNP)得形式存在,其中DNP能溶于水及高浓度盐溶液,但在0、14 M得盐溶液中溶解度很低,而RNP则可溶于低盐溶液,因此可利用不同浓度得NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来。将抽提得到得DNP用SDS处理可将其分离DNA与蛋白质,用氯仿
7、-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得DNA上清,加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出。四、实验器材与材料试剂实验器材: 匀浆器 量筒 离心机 离心管 试管 吸管 恒温水浴锅实验材料: 猪肝实验试剂: 0、1mol/L NaCl-0、05mol/L 柠檬酸钠溶液(pH6、8) 95%乙醇(A、R、) NaCl固体(A、R、) 5%SDS溶液(5g SDS 定容至100ml) V(氯仿):V(异戊醇)20:1得混合液五、实验操作1、称量称取一定质量得猪肝,加入2倍肝重得0、1mol/L NaCl-0、05mol/L柠檬酸钠缓冲液并用匀浆器磨碎(已完成)。2、提取DNA量取肝糜4 ml 于10毫升离心管,在400
8、0r/min下离心10min ,沉淀中再加入8 ml缓冲液于4000r/min离心5 min;弃上清,取沉淀;将沉淀用10 ml柠檬酸钠缓冲液完全洗入干净得小烧杯、加入5 ml 氯仿-异戊醇混合液、1 ml SDS,振荡30min(保鲜膜封口);缓慢加入固体NaCl(约0、9g),使其最终浓度为1mol/L;将溶液分装到2个10毫升离心管中,在4000r/min离心5 min,取上清水相;在上述水相溶液中分别加等体积冷95%乙醇,边加边用玻棒慢慢朝一个方向搅动,将缠绕在玻棒上得凝胶状物用滤纸吸去多余得乙醇,即得DNA粗品;用8ml蒸馏水溶解DNA粗品于10ml离心管中。3、标准曲线得绘制按下表
9、加入各种 试剂,混匀,于60恒温水浴锅45min,冷却后,在595nm波长下于分光光度计比色测定,以吸光度对DNA浓度作图,制作标准曲线。012345标准DNA溶液/ml0、00、40、81、21、62、0蒸馏水/ml2、01、61、20、80、40二苯胺试剂/ml4、04、04、04、04、04、0A595nm4、样品得测定将DNA粗品定容至25ml容量瓶,再取DNA样液1、0ml,加入蒸馏水1、0ml,混匀。然后准确加入二苯胺试剂4、0ml,混匀,于60恒温水浴锅45min,冷却后,595nm波长下于分光光度计比色测定,根据所测得吸光度对照标准曲线求得DNA得质量(ug)。5、计算100g
10、猪肝中DNA含量w=m1/m2100%w:DNA得质量分数(%)m1:样液中测得得DNA得质量(ug)m2:样液中所含样品得质量(ug)六、实验数据处理1、标准曲线012345标准DNA溶液/ml0、00、40、81、21、62、0蒸馏水/ml2、01、61、20、80、40二苯胺试剂/ml4、04、04、04、04、04、0A595nm00、0390、090、1460、1970、249DNA含量/ug0801602403204002、实验结果处理猪肝质量为2、04gDNA提取液体积为12、53ml序号123A595nm0、1020、1020、101平均A595nm0、102样液中DNA含量/
11、ug171、4样液中样品质量/g0、1628根据公式w=m1/m2100%得:w=0、1053则100g猪肝中DNA含量为:w100=0、1053g七、思考题1、实验中得乙醇、SDS、氯仿-异戊醇、NaCl、柠檬酸钠分别有什么作用？答:柠檬酸得钠盐在实验中既充当DNA酶得抑制剂,也就是pH缓冲溶液;SDS就是表面活性剂,可以让蛋白质与DNA分开;氯仿就是有机溶剂,可以使蛋白质聚集沉淀,便于分离出去;异戊醇就是消泡剂,可以减少泡沫得发生;氯仿-异戊醇得作用就是使蛋白质变性、膜溶解;NaCl固体溶解使得试液成为高浓度得盐溶液,在这样得环境中DNA核蛋白能溶解,RNA核蛋白则溶解度很低,可以利用这一
12、性质分离两种核酸。八、实验注意事项1、DNA主要集中在细胞核中,因此,通常选用细胞核含量比例大得生活组织作为提取制备DNA得材料,小牛胸腺组织中细胞核比例较大,因而DNA含量丰富,同时其脱氧核苷酸酶活性较低,制备过程中DNA被降解得可能性相对较低,所以就是制备DNA得良好材料,但其来源较困难,脾脏或肝脏易获得,也就是实验室制备DNA常用得材料,本实验用新鲜肝脏作为实验材料。2、为了防止大分子核酸在提取过程中被降解,须采取以下措施:整个过程必须在低温下进行,可加入某些物质抑制核酸酶得活性,如柠檬酸钠、EDTA、SDS等,EDTA就是抑制核酸酶得活性最好得抑制剂。3、从核蛋白中脱去蛋白质得方法很多
13、,经常采用得有:氯仿-异丙醇法、苯酚法、去垢剂法等,她们均能使蛋白质变性与核蛋白解聚,并释放出核酸。4、使用离心机时,对称放置得离心管必须用天平调平衡。5、避免剧烈振荡,如研磨过程、搅拌过程等。九、实验结果误差分析及讨论经过对本次实验结果进行分析,得出100g猪肝中DNA含量大约为0、1053g得结论,在上网查阅相关资料后发现:猪肝中DNA含量与本次试验实际操作测量得出得结果大致相互吻合。由此可知,本次试验结果就是相对比较成功得,较为粗略地测量出猪肝中DNA得含量,并且较为熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取DNA得原理与技术,基本达到了本次实验得目得。但就是本次实验结果只就是粗略测量,并未达到
14、精确测量猪肝中DNA得含量,且实验数据较理论值偏低,这就是由于某些误差导致,在实验过程中些许因素可能会导致实验结果数据有偏差,经分析得出以下几点:在称取猪肝后加入柠檬酸钠缓冲液进行研磨得过程中,由于猪肝组织表面较滑不易磨碎,且研磨至最后依旧有小部分猪肝组织块残留,因此可能导致猪肝中DNA提取不充分,致使实验数据较理论值偏低;研磨过程中,可能由于操作不当,导致部分液体溅出,因此可能使得提取液中部分DNA损失,导致实验数据偏低;在粗提取DNA操作中,频繁地将DNA提取液转移至各个仪器内,可能有极小部分DNA提取液未倒净,残留在仪器壁上损耗掉,导致实验误差;在使用移液枪得过程中,可能因为操作不当或移液枪经常错误使用,出现仪器误差,导致吸取得DNA样液不精确,出现实验误差;在水相中加入乙醇析出DNA时,不就是所有DNA均析出,有小部分依旧融在溶液,导致提取出得DNA含量偏低;标准曲线制作过程中出现些许误差;总得来讲,本次试验结果就是相对比较成功得,较为粗略地测量出猪肝中DNA得含量,并且较为熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取DNA得原理与技术,基本达到了本次实验得目得。在今后得实验中会着重注意实验操作得严谨性,严格按照实验前拟定完全得实验步骤进行,保证将实验操作过程中可能出现得误差概率降到最低,尽可能达到预期得实验效果,完成自我得学习及锻炼过程。
