凝胶色谱法

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1、精选优质文档-倾情为你奉上凝胶色谱法凝胶色谱系统凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称。凝胶色谱法主要用于的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。目前已经被、以及等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于生产。 凝胶色谱法-分类根据分离的对象是的还是有机溶剂可溶物，又可分为（GFC）和（GPC）。 凝胶色谱仪凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶的代表是系列，洗脱溶剂主要是水。凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (

2、、等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为等有机溶剂。凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。凝胶渗透色谱技术原理凝胶色谱法-分子筛效益一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的，而只能分布颗粒之间

3、，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫。具有多孔的凝胶就是。 凝胶色谱法原理各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫。两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果

4、两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距

5、离较长。于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小排队，凝胶表现分子筛效应。凝胶色谱法-凝胶种类及性质（一）聚丙烯酰胺凝胶 凝胶色谱柱聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位， 由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶P （Bio-Gel P），由日本tosoh的TSKGEL的

6、pw系列，适合蛋白和多糖的纯化。即丙烯酰胺和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺，在催化剂过硫酸铵作用下聚合形成凝胶。聚丙烯酰胺（PAM，polyacrylamide）聚丙烯酰胺简称PAM，分子量100500万。聚丙烯酰胺主要有两种商品形式，一种是粉末状的，另一种是胶体，还有聚丙烯酰胺乳液 (合成树脂研究所研制) 。易溶于冷水，速度很慢，高分子量的聚丙烯酰胺当浓度超过10以后就会形成凝胶状结构。提高温度可以稍微促进溶解，但温度不得超过50，以防发生分子降解。难溶于有机溶剂。温度超过120 时分解。中性，无毒。用作、，具有凝胶、沉降、补强等作用。贮存于阴凉、通风、干燥的库房内，防潮、避光、防热。存放时间不宜

7、过长。（二）交联葡聚糖凝胶（Sephadex） Sephadex G 交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。 Sephadex LH-20，是Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。（三）糖凝胶 凝胶色谱仪琼脂糖 Agarose，缩写为

8、 AG，是琼脂中不带电荷的中性组成成份，也译为琼胶素或琼胶糖。琼胶糖化学结构由-D-吡喃半乳糖 (1-4) 连接3,6-脱水-L-吡喃半乳糖基单位构成。把琼脂糖，即几乎不含根的主要成分为多糖的琼脂，溶于热水，冷却制成的凝胶。制成的小颗粒用于凝胶过滤。适于用sephadex不能分级分离的大分子的凝胶过滤，若使用5以下浓度的凝胶，也能够分级分离细胞颗粒、病毒等。利用其吸附性小的特点，有时用它代替琼脂、以作为免疫或凝胶内沉降反应的支持物。琼脂糖凝胶商品名很多，常见的有，Sepharose（，pharmacia ），Bio-Gel-A（，Bio-Rad）等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持

9、网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用 凝胶色谱（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。（四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel，具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用。凝胶色谱法-填料合成技术 凝胶色谱填料合成技术的进展主要在下面四个方面：填料的微球化、窄粒度分布多孔硅微球的合成成功、小孔径多孔硅微球合成成功以及新的硅微球表面化学的发展。近年来在这方面有较多的新产品

10、，也有许多单位在研制和生产。高效凝胶色谱正在迅速改变凝胶色谱的应用面。 凝胶色谱图高效色谱柱除了对填料的粒度有要求外，对粒度分布也要求相当窄。用一般的制备方法往往得到粒度较宽的产品，需要进一步过。当填料的粒度在30微米以下时，这种过筛非常困难，已经成为填料制备上一个较大的技术难关。Kirkland，最近利用了和在酸性中形成大小均匀的液体高聚物，加入某种硅溶胶时，硅溶胶的微珠将在液体高聚物中凝聚。最后把有机高聚物灼烧掉后就能得到由微粒硅珠堆积而成的多孔填料。这种堆积硅珠是球形的，粒度分布很窄，填料的孔径决定于原始硅溶胶的规格，用不同的硅胶就可以制得不同孔径的填料。柴志宽等则利用一种硅胶制成粒度分

11、布窄的填料后，再利用适当的扩孔方法以得到各种孔径的填料。从这些方法制得的微球填料，粒度分布可以达到相当窄，所以可以不经筛选直接使用。 随着进样技术和色谱柱接头设计的改进，现在已经可以得到柱效每米在八万到十万的凝胶色谱填料。Wheals用四种GPC用的微球硅胶装填色谱柱，都能达到每米八万到十万块的高效。他用这种色谱柱有效地进行了案件中所要求的分析问题。四种多孔硅胶的理论塔板数凝胶色谱法-实验技术 凝胶色谱柱（一） 层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用或有机玻璃管。层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。

12、此外，直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米。分族分离时用短柱，一般凝胶柱长20-30厘米，柱高与直径的比较5：110：1，凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。分级分离时柱高与直径之线为20：1100：1，常用凝胶柱有5025厘米，1025厘米。层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支掌滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000。（二）凝胶的选择 凝

13、胶色谱柱根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如Sephadex G-20的吸水量为20，1 克Sephadex G200吸水后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细胞分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的Sephadex G-200效果好，脱用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。（三）凝胶的制备商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别

14、是在使用软胶时，自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。（四）样品溶液的处理 样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去， 凝胶色谱净化系统如含脂类可高速离心或通过Sephadex G-15短柱除去。样品的粘度不可大，含蛋白为超过4，粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4（一般约0.5-2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10，在溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30。分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。（五）防止的污染交联

15、葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的有： 叠氨钠在凝胶层析中只要用0.02叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶于水，在20时约为40；它不与蛋白质或相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。 可乐酮 凝胶色谱软件在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60时易引起分解而失效。 乙基汞代巯基水杨酸钠在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0. 01。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。 苯基汞代盐 在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含巯基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。凝胶色谱法-高效凝胶色谱 在整个领域里，高效液体色谱取代经典的液体色谱的趋势是非常迅速的。这是由于色谱理论、制备技术和仪器合理设计三方面联合发展的必然结果。凝胶色谱向高效阶段发展就其本身来说