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1、分类号 密级 U D C 编号 G20020249 学 位 论 文金桔组织培养及其形态发生与生理生化变化Tissue culture of Fortunella margarita（Lour.）Swingle and its morphological and physiol-biochemical changes曾 明指导教师姓名： 杨柏云 教授 南昌大学生命科学学院 申请学位级别： 硕 士 专业名称： 植 物 学 论文提交日期： 2005年5月 论文答辩日期：2005年6月学位授予单位和日期： 南昌大学 2005年6月 答辩委员会主席： 评阅人： 2005年5月日38目 录摘 要IVAbs
2、tractV引 言1文献综述21 植物组织培养概述22 组织培养在柑桔研究中的应用22.1 遗传育种32.1.1 杂种育种32.1.2 单倍体育种32.1.3 三倍体育种（无核育种）42.1.4 抗性育种42.2 无病毒苗培养52.3 离体种质保存62.4 组织形态学研究72.5 生理生化研究72.6 柑桔基因工程83 问题与展望94 本研究的意义9材料与方法111 材料112 方法112.1 金桔上胚轴离体培养再生体系的建立112.1.1 愈伤组织的诱导112.1.2 愈伤组织的分化122.1.3 生根培养122.2 离体培养过程中解剖学观察132.2.1 愈伤组织诱导过程的解剖学观察132
3、.2.2 愈伤组织分化过程的解剖学观察132.3 离体培养过程中同工酶变化132.3.1 酶样的制备132.3.2. 电泳贮液配制142.3.3 电泳142.4 可溶性蛋白含量变化的测定162.4.1. 愈伤组织诱导阶段取样162.4.2 愈伤组织分化阶段取样162.4.3 蛋白质含量测定16结果与分析171 金桔上胚轴离体培养体系的建立171.1 愈伤组织的诱导171.2 愈伤组织的分化181.3根的诱导192 离体培养过程中的解剖学观察202.1上胚轴的解剖学观察202.2 愈伤组织诱导过程中的解剖学观察202.3 愈伤组织分化过程中的解剖学观察203 离体培养过程中几种同工酶的变化213
4、.1. 过氧化物酶（POD）的变化213.2 超氧化物歧化酶（SOD）的变化223.3 过氧化氢酶（CAT）的变化223.4 苹果酸脱氢酶（MDH）的变化234上胚轴离体培养过程中可溶性蛋白含量的变化244.1 愈伤组织诱导阶段可溶性蛋白含量变化244.2 愈伤组织分化阶段可溶性蛋白含量变化24讨 论251 愈伤组织的诱导与分化251.1 外植体因素251.2 激素对愈伤组织诱导的影响261.3 激素对愈伤组织分化的影响262 生根培养273 离体培养中解剖学化特点274 同工酶变化与愈伤组织诱导和分化的关系285 可溶性蛋白含量变化与愈伤组织诱导和分化的关系29结 论31参考文献32附图36
5、致 谢38摘 要本研究以金桔上胚轴为离体培养材料，研究了愈伤组织诱导和器官发生的适宜条件，建立离体培养再生体系。通过石蜡切片观察了离体培养过程中外植体形态发生的变化过程；用紫外分光光度法和聚丙烯酰胺凝胶电泳分别研究了离体培养过程中可溶性蛋白含量和几种同工酶的变化。实验结果表明：6-BA和NAA适当浓度配比对离体诱导和分化有促进作用，愈伤组织诱导以6-BA 1.5mg/L + NAA 1.0mg/L为佳，第24d愈伤组织增长20.3倍。愈伤组织分化以6-BA 1.5mg/L + NAA 0.5mg/L为佳，分化率为75%。生根培养时，较高的NAA浓度（1mg/L）易产生愈伤组织，较低浓度无机盐有
6、利于生根，以1/2 MS + NAA 0.5mg/L较好。金桔上胚轴离体再生为器官发生型，芽体多由愈伤组织内部形成，少数由愈伤组织表面发生。过氧化物酶（POD）中POD1与诱导过程的启动有关；POD2、POD5和POD6在诱导12d天出现，是愈伤组织快速增殖的标志；POD4在一开始诱导就消失，到分化培养第24d再现，与芽的形成有关。超氧化物歧化酶（SOD）中SOD3在愈伤组织诱导第12d消失，是愈伤组织快速增殖的标志；SOD2和SOD6均在分化第24d出现，是形成芽的标志。过氧化氢酶（CAT）只出现一条酶带，其稳定表达，对维持细胞代谢环境的稳定有重要作用。苹果酸脱氢酶（MDH）在诱导阶段逐渐变
7、强，在出芽前后有一个波动；MDH4在诱导第2d出现，到分化第24d后消失，可能为离体培养中特殊生理代谢所需。可溶性蛋白含量在愈伤组织诱导阶段，呈现“W”形变化，第4d时出现一个小峰，之后呈上升趋势，这与诱导过程的启动及愈伤组织增殖相一致；在愈伤组织分化阶段呈“U”形变化，分化第1d-18d逐渐下降，之后又上升，这与愈伤组织分化初期消耗可溶性蛋白及新芽发生时蛋白质快速合成相一致。关键词：金桔离体培养形态发生同工酶AbstractEpicotyls of Fortunella margarita (Lour.) Swingle were cultured in vitro in this stud
8、y. To set up the in vitro regeneration system, the conditions for callus induction and organogeny were studied. The morphologic change during culture was observed through paraffin slice; the content of soluble protein was mensurated through ultraviolet spectrophotography, and changes of isozymes wer
9、e analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis. The results indicated as follows: Appropriate combination of 6-BA and NAA can be effective in callus induction and redifferentiation. The optimal concentration for callus induction is 6-BA 1.5mg/L+NAA 1.0mg/L, with the increment of 20.3 times on 24th
10、 day; as for callus differentiation is 6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L with the differentiation rate of 75%. The in vitro regeneration of Fortunella margarita (Lour.) Swingle epicotyl is organogeny type, most buds are formed inside the callus, some are originated from surface. During root induction, relati
11、vely high concentration of NAA (1mg/L) was easy to produce callus, and relatively low concentration of salt is good for rooting, 1/2MS + NAA 0.5mg/L is preferable. Among the peroxidase (POD), POD1 has relation to the startup of induction and proliferation; POD2, POD5 and POD6 appeared on the 12th da
12、y of induction, they are signs of the fast increase of callus; POD4 disappeared since the beginning of induction, but reappeared on the 24th day of differentiation, its has relation to buds forming. Among the superoxide dismutase (SOD), SOD3 disappeared on the 12th day of callus induction, it is als
13、o a sign of the fast increase of callus; SOD2 and SOD6 appeared on the 24th day of differentiation, they are the signs of bud forming. Catalase (CAT) showed only one band, its stable expression is important for maintaining the stabilization of cell metabolism circumstance. Malic dehydrogenase (MDH)
14、got intense during callus induction, but showed a fluctuation when buds emerged; MDH4 appeared since the 2nd day of callus induction, but disappeared on the 24th day of callus differentiation, it maybe needed in special physiological process of in vitro culture. During callus induction the concentration of soluble protein presented W shape change, there was a little pick on 4th day, and went up after that, this is consistent to the startup of induction and increase of callus; during callus different
