《PCR假阴性的原因分析.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PCR假阴性的原因分析.doc（20页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 PCR假阴性的原因分析 PCR的假阳性问题是在PCR诞生之初就被深刻认识到了，同时由于造成假阳性的因素相对单一，因此假阳性并不是困惑检验工作的主要原因。如果一个项目只是阳性率高敏感性好的话，那么可以认为其阴性结果具备很高的可排除性，仍然有相当的临床适用价值。但PCR的假阴性在检验工作中仍很严重，并且用些因素经常被人忽略，严重的影响了PCR的使用。可以想象一种假阳性和假阴性都很高的项目，有什么样的诊断价值。造成PCR假阴性的原因是复杂的，也是多样的。主要有：1.PCR仪本身的质量问题。PCR仪设计原理上的差异和经常出现的质量问题（如：温控不准等）给临床带来了诸如非特异性扩增（假阳性）、扩增效率
2、下降(假阴性）等问题.2.离心机问题。离心机的质量或使用不正确，造成离心标本模板没有分离出来造成假阴性，窃以为这是最易被忽视的问题。其时离心机使用问题不仅在PCR，在整个检验工作中都是最易被忽视的问题，只是因为在其他工作中不象PCR那样明显影响检测结果罢了。离心机是常用的固液分离设备，其利用离心过程中的离心力而将密度不同的物质分离出来。因此离心机的关键在于离心加速度而不是转速，根据牛顿定律可知离心力加速度与转速和有效半径的有关的，因此对于不同有效半径的离心机相同的转速其离心加速度是不同的，转速的调节要因离心机而异，但很遗憾，日常工作中忽视了这个问题。有效半径短的离心加速度就小，同样的时间离心效
3、果就差可能造成分离不出导致假阴性。同时由于高速离心机高速旋转与空气摩擦会产生大量的热，因此对于称能上几万转/分而没有抽真空的离心机实际转速本人持怀疑态度。3.试剂开壳剂和操作问题造成标本DNA没有暴露出来，致使扩增无法进行，这是造成假阴性的又一主要因素。 PCR扩增方面的技术解答1、PCR括增的基本原理 PCR (Polymerase Chain Reaction) 是体外高效复制DNA的技术，该技术几乎贯穿于现在分子生物学的各个领域。PCR体系由模板，特异性引物，高温聚合酶，脱氧核糖核酸几部分组成。反应过程分模板高温变性（Denaturation），引物与模板低温退火（Annealing）,
4、引物在高温聚合酶的作用下延伸（Extention），在一定的条件下，退火和延伸可以合二为一。 2、高温聚合酶分类 高温DNA聚合酶主要用于DNA片段的高温快速扩增（合成），它以单链DNA或RNA为模板，在dNTP和Mg离子存在时，在特定的引物引导下按5-3的方向合成DNA。目前，用于高温DNA合成聚合酶就其本身的特性分成三类： 第一类酶具有5-3方向的DNA合成（聚合）性能，没有3-5方向的外切酶特性。如Taq DNA聚合酶及其突变体。这类酶合成延伸能力比其它DNA聚合酶强，因为它不能纠正合成过程中出现的突变。 第二类和第一类酶类似，它有合成特性，没有3-5方向的外切酶活性，即不具备保真性能。
5、不同的是它们能以RNA为模板，合成DNA。也就是说它们具有逆转录功能。如Tth DNA聚合酶。 第三类酶具有第一类酶的DNA聚合特性，不拥有第二类酶的逆转录功能，但是它们具有3-5方向的外切酶活性。如Pfu DNA聚合酶。正是酶本身具有的外切酶活性，Pfu能够纠正DNA扩增过程出现的错误，如点突变。不足之处是该类酶的DNA延伸能力不及其它两类。目前人们试图用各种手段来提高第三类酶的延伸性能，它在现代分子生物学实验中越来越收到重视。 3、如何选酶? 根据扩增产品的用途确定。第一类酶如Taq DNA聚合酶的主要用于检测基因或特定DNA片段是否存在，制备DNA探针，T/A克隆时在DNA片段末端添加单
6、个碱基，和Pfu一道用于较长DNA片段的扩增。这类DNA扩增，DNA片段中可能存在的突变不影响实验结果。 第一类酶大多数使用场合，第二类酶都可以用。需要注意的是Tth的长链PCR扩增的能力不及Taq酶。人们更多注意的是Tth的逆转录功能，用它来实现基因单管单个酶的RT/PCR扩增检测。和传统的AMV和MMLV 逆转录酶相比，Tth的RT是在高温下进行的，能有效的解除RNA中的二级结构，是扩增出的基因更为完整。不足之处：Tth的RT能力不及AMV和MMLV 逆转录酶。第三类酶以Pfu DNA聚合酶为代表。 Pfu是已知DNA聚合酶中，保真性最高的聚合酶。它扩增出的DNA产物，随机突变少，保证性能
7、为Taq DNA聚合酶的10倍以上。Pfu主要用于克隆表达基因片段的合成，用于DNA突变实验。如果要求扩增DNA片段中的错误特别少，减少下游分子操作不必要的回复突变工作。高保真DNA扩增，使用Pfu DNA聚合酶是唯一的选择。需要指出的是：用Pfu的DNA扩增，突变少，但不是无突变无错误扩增。Pfu的不足之处是扩增能力较差，2kb以上的基因扩增需要优化反应条件。 将第一类或第二类与第三类酶按特定比例混合，能部分提高PCR扩增的长度和产物的保真性。我们提供的Taq Plus和SuperTaq属于这类产品。这类产品的保真性一般为Taq酶的2倍左右。S公司声称Taq Plus的保真性达到Pfu的水平
8、是没有科学根据的,是极其不负责任的。 4、如何选择酶的供应商? 用可靠可信的酶。国外品牌公司的酶质量是有保证的。理论上生产Taq的工艺不复杂，但是从非专业性生产商出来的产品往往不做严格的产品控制，他们的价格虽然低，但是给您研究带来的潜在的威胁很大。很多公司没有生产能力，为追求最高利润，经常更换供应商。产品的稳定性受到影响。一般情况下他们不做质量控制。您买酶前最好问问他的酶是谁生产的，如果您仅仅被告知是国产和进口的，而不能告知明确的生产商，最好不要购买。 5、遇到问题怎么办? 影响DNA扩增的因数很多，酶的质量是个重要因素。 本公司提供的各类酶质量都经过严格的质量控制。使用本公司提供的各种DNA
9、聚合酶一般可以排除产品本身的质量问题。影响DNA扩增效率的几个重要因数：模板性质和用量、Mg离子的浓度、退火温度等。实际上 PCR扩增没有什么特殊的规律，做多了，您就成为专家了。如果您还不能得到满意的答案，请直接向申能博彩咨询。 6、如果您不能扩增出产物，表明您使用的试剂或过程有问题吗？ 不一定。有些扩增，您的引物，PCR扩增使用的酶，dNTP可能都没有问题，只是可能您没有使用最合适的条件。有些基因表达量就是低，常规的PCR可能就没有办法扩增出来。如果所有的基因都是那么容易扩增出来，那有那么多形式的PCR技术如槽式PCR,Hot Start PCR, LA PCR。如果有时引物设计不合理，靠扩
10、增技术的改进也不一定能弥补。 7、RT-PCR技术难吗？ 不难。但是您的心态要对。您不要指望您的基因如扩Actin那么容易，也不要指望3k的cDNA一下子就能扩增出来。我们注意到，降解现象非常严重的样品中，扩增beta Actin也是轻而易举的事情。实际上能扩增出Actin，只能说明PCR扩增系统没有问题，不能说明您的 RNA就一定完好。RT-PCR的关键是RNA的质量，如果您的RT没有问题，PCR跟不会有问题。 8、基因表达水平检测需要注意什么问题？ 研究人员常常需要检测特定基因的表达水平，检测的手段很多，主要有Northern, 半定量RT-PCR, 荧光定量PCR(real time P
11、CR),基因芯片的手段。很难用几行字来说清楚这些技术的优缺点。 Northern方式比较直观，但是难以批量进行，劳动量较大；半定量RT-PCR,被一些学员所推崇，因为很多实验室都可以做，但是半定量RT-PCR的关键要保证所有样品的可比性非常困难，内参需要与待检测基因同管扩增，但是由于内参基因表达水平太高，常常抑制检测基因的扩增，常常是分开扩，都可以扩增出来，混在一起就没有了，所以有时不能反映基因表达的实际情况。目的基因和内参基因分开扩增的所谓半定量RT-PCR，没有什么学术意义。荧光定量PCR，在学术界和临床诊断都被广泛采用，该技术能比较真实反映基因的表达水平，实时监控PCR扩增，数据处理自动
12、化和数字化。荧光定量PCR需要采用具有5-3外切酶活性的Taq酶扩增，合成一对普通引物和一条荧光双标记的Taq-Man探针。要准雀体现表达水平，半定量RT-PCR, 荧光定量PCR扩增的循环数比常规少，扩增产物一般都要求处在线性区，如果扩增过程已到达平台区，扩增产物就不能反映基因拷贝数的高低。基因芯片的基本原理和Northern 基本相同，类似于点杂交，都是采用杂交原理，差别是基因芯片一般采用荧光探针，可以同时比较很多样品，可以批量处理和自动化。不足之处是检测设备费用高，假阳性的比较高，需要其他方式予以验证。 9、PCR扩增过程中若干影响因素？ 引物：在Tris缓冲液中，引物可以低温保存相当长
13、的时间。除非有核酸酶的污染，引物一般非常稳定。笔者使用过10年前的引物，仍然好用。问题的关键在于您的引物设计是否合理，使用过程是否规范。如果您怀疑引物有问题，可以选择重合。如果重合后，还没有改善，请查其他原因。引物到用户手头前都是以干粉形式存在的，干粉很容易丢掉，引物溶解后可以测定一下OD，将所有引物的浓度调整到一致，对实验有一定帮助。 高温聚合酶：高温聚合酶是非常稳定的，除非有蛋白酶的污染。但是不同公司提供的酶扩增是有差异的，活性定量和标示未必相同。选用表现一贯稳定的酶，而不是最便宜的。当然，便宜又好最好，哪里有？我们这里啊！ dNTP: dNTP是PCR扩增体系中最不稳定的，反复冻融会使d
14、NTP发生降解。dNTP是由dATP,dCTP,dGTP,dTTP等摩尔组成，但是他们的稳定性不同，发生降解的程度不同，导致4种dNTP的浓度不一致，即使不发生降解，4种 dNTP如果浓度不等，PCR效率和正确率都会受到影响。建议分装小包装，减少反复动容冻融的次数。 缓冲液：缓冲液一般不容易出问题，只是使用前需要彻底融化混匀使用。如果您PCR不熟悉，使用含Mg的缓冲液。缓冲液中可以加入适量的甘油、DMSO等增强剂，目的是改善高GC含量等疑难模板的扩增。 Mg2+:是TAQ活性所必须的，浓度过高过低对反应都有比较大的影响。过低（3mM），非特异性会加大。很多因素会使Mg2+的实际浓度受到影响，如
15、TE中的EDTA, 反应用的dNTP等都会螯和Mg. 温度：变性和退火温度是主要需要考虑的。变性温度过高（一般在90-94C），时间过长（一般45-60秒足够），酶的活性会受到影响，同时影响产率。对于退火温度，过低非特异性扩增增加，过高产率会下降。需要根据引物的长度，用途，组成确定退火温度和时间。 模板：PCR 的关键之一，模板不是越多越好。可以通过倍比稀释来确定合适的浓度。纯度,不是最重要，但是不能有抑制Taq活性或螯和Mg 的试剂存在。模板的pH值接近中性为合适，否则会影响扩增体系的pH值。 10、PCR产物的克隆常用方法？ PCR扩增如采用Pfu DNA Polymerase产物末端为平端; 如用Taq DNA Polymerase扩增，PCR产物的3 末端通常为单个碱基A。 PCR产物克隆常用的方法有3： l：平端克隆，但效率低，对于Taq扩增的产物需要除去 末端通常为单个碱基A。Pfu扩增的可以直接用平端连接。 ：在引物两端设计合适的酶切位点，PCR扩增后，酶切克隆。但PCR产物直接酶切效率低，克隆成功率不高。 ：最为有效的是T
