《大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1. 提取目的基因：既从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。2. 提取质粒：使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒为环状DNA.3. 基因重组：取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用DNA连接酶将目的基因与质粒”缝合”，形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。4. 将质粒送回大肠杆菌：再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质，如CaCl2,这使细胞会吸收外源基 因.此时将重组的质粒也放入培养液中，大肠杆菌便会将重组质粒吸收.5. 胰岛素的产生：再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后，便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆
2、 菌的大量繁衍，便可大量生产出胰岛素！学习要求知道DNA的粗提取与鉴定的原理;掌握并能分析DNA粗提取的技术 方法和要求；学会DNA分子的鉴定方法【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论,完成下列问题，并初 步巩固.【活动1】阅读教材？54 “基础知识”，讨论并回答下列问题：1. （记忆）提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。2. （记忆）DNA的溶解性特点：DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。【思考1】据图5 1分析：DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点?在014mol/L时溶解度最小；要使DNA溶解，需要使用什
3、么浓度?较高浓度，可使DNA溶解；要使DNA析出，又需要使用什么浓度？ 014mol/L可使DNA析出.【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理，可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目 的.3. （记忆）DNA的耐受性特点：蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA；在6080，C时蛋白质变性沉淀而DNA分 子不变性。洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。4. （记忆）DNA的鉴定原理当鉴定提取出的物质是否是DNA时,需要使用二苯胺（甲基绿）进行鉴定.在 沸水浴条件下，该试剂与DNA反应，呈现（浅）蓝色。二、实验设计【活动2】阅读教材？55 “实验设计”，讨论并回答下列问题：1. （记忆）实验材
4、料的选取：选取材料时应本着DNA含量高、材料易得、便于提 取的原则。【思考3】你认为教材提供的材料中哺乳动物的血液不适合提取DNA.2. （记忆）破碎细胞，获取含DNA的滤液：鸡血：向鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并玻棒搅拌,用纱布过滤后,收集滤 液。洋葱：向研钵中加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，用纱布过滤后,收集滤 液。【思考4】在以上实验中，蒸馏水的作用是使血细胞大量吸水而胀裂，洗涤剂的 作用是瓦解细胞膜，食盐的作用是溶解DNA物质。3. （学会）去除滤液中的杂质：方案一 :30mL滤液一加NaCl使DNA溶解一过滤得滤液一加蒸馏水使DNA析出 f过滤得过滤物f放到2mol/LNaCl溶液
5、中溶解一DNA NaCl溶解液方案二:30mL滤液一加嫩肉粉（木瓜蛋白酶）一静置10分钟一得DNA滤液方案三:30mL滤液一6067C处理一过滤得DNA滤液【思考5】以上三个方案的原理分别是什么？方案一原理：DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;方案二原理：蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA;方案三原理：DNA耐高温而蛋白质不耐高温。【思考6】方案一中：“加NaCl使DNA溶解一过滤得滤液”的目的是除去不溶 （可溶、不溶）于NaCl溶液中的细胞杂质；“加蒸馏水使DNA析出一过滤得过滤物”的目的是除去可密（可溶、不溶）于NaCl溶液中的细胞杂质.4. （记忆）DNA的析出：DNA滤液与等体积冷却
6、酒精混合，静置一段时间后析出的白色丝状物就是DNA。5. （记忆）DNA的鉴定：取2支洁净的试管，编号甲、乙，各加入等量的2mol/LNaCl溶液.甲中放入 少量白色丝状物，使之溶解。在甲、乙试管中各加4mL二苯胺，混合均匀。沸水 浴5min，观察颜色变化，甲试管呈现蓝色。三、操作提示【活动3】（记忆）阅读教材？56“操作提示和P57“课题延伸”，关注下列注 意事项:1. 在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心后除去血浆，以提高细胞 悬液浓度.2. 实验中使用塑料烧杯和尼龙布，以免DNA被吸附.3. 玻棒沿同一方向缓慢搅拌（细胞破裂时快速搅拌）,玻棒不要碰到烧杯壁.4. 二苯胺试剂要现用
7、现配.5. 为提高DNA纯度，实验中通常使用的洗涤剂有CTAB、SDS等.【活动4】观看视频:观看“DNA的粗提取与鉴定”视频，体会并学会相关技术 方法。课后学习1. 尝试从植物组织中提取DNA分子.2. 基础训练册：将基础知识整理到作业本上；完成该节训练题.学习要求尝试PCR技术的基本操作，体验PCR技术的分子生物学实验方法;理解PCR技术的 原理;讨论PCR技术的应用【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并 初步巩固。一、基础知识【活动1】阅读教材？58 “PCR原理”，讨论并回答下列问题:1. （记忆）PCR技术扩增DNA的过程与细胞内的DNA复制过程类似。【
8、思考1】填写下表：（记忆）细胞内DNA复制条件分析条件参与的组分在DNA分子复制中的作用模板DNA的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料酶解旋酶打开DNA双螺旋RNA聚合酶合成RNA引物DNA聚合酶催化合成DNA子链；切除引物DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来能量ATP为解螺旋和合成子链提供能量引物RNA为DNA聚合酶提供合成的3端起点2. （理解）细胞内DNA的复制（1） DNA的结构:脱氧核苷酸分子通过3, 5 一磷酸二酯键连接形成核苷酸长链, 两条脱氧核苷酸长链反向平行排列并螺旋化,形成DNA双螺旋结构。DNA的复制：首先，在解旋酶的作用下，由ATP供能，D
9、NA发生解旋形成两 条DNA单链。其次，在DNA单链的匕端，在RNA聚合酶在作用下，合成RNA引物。再次，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3端开始合成DNA子链.最 后，DNA聚合酶将引物切去，并合成空缺处DNA单链，再由DNA连接酶将不 连续的DNA子链连接起来。3. （记忆）DNA分子复制的人工控制解开螺旋：在80100C时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性.恢复螺旋：在5060C左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性.复制条件：缓冲液,DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引 物。控制仪器：PCR仪（温度周期性自动调节仪）。【思考2】缓冲液相当细胞
10、内的什么成分？核液。【活动2】阅读教材？59 “PCR的反应过程,讨论并回答下列问题：1. （记忆）填写PCR反应流程：2. （理解）PCR反应过程是:在升温至90C以上时DNA解旋；在降温至50C左 右时引物与DNA单链结合；在升温至72C左右时合成DNA子链。二、实验操作 【活动3】阅读教材？62“实验操作”，讨论并回答下列问题:1. （记忆）在PCR反应体系的配方中，含有的成分有缓冲液、DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物、水。2. （了解）实验操作步骤：按照PCR反应体系配方配制反应液；将PCR反应体系50UL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；将微
11、量离心管放到PCR 仪中；设置PCR仪的工作参数;DNA在PCR仪中大量扩增。3. （了解）水浴法:将微型离心管依次在95C、55C、72C恒温水浴锅中循环 处理。三、操作提示【活动4】阅读教材？62“操作提示”，讨论并回答下列问题：1. （记忆）避免外源DNA污染，所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌.2. （记忆）将缓冲液和酶分装成小份，20C低温保存.3. （记忆）每添加一种反应成分,更换一个移液器枪头.4. （记忆）混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。四、结果分析与评价【活动4】阅读教材？63“结果分析与评价”，讨论并回答下列问题：1. （记忆）反应液稀释:取2? LPCR反应液，添加98?L蒸馏水.2. （记忆）分光光度计调零：将100?L蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计读数调节为零。3. （记忆）将100? L反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值.4. （记忆）DNA含量计算：DNA含量（？ g） =50X光吸收值X稀释倍数.【活动4】观看视频：观看“多聚酶链式反应扩增DNA片段视频，学会相关技术 方法.课后学习1. 尝试从植物组织中提取DNA分子。2. 基础训练册：将基础知识整理到作业本上；完成该节训练题。
