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1、细胞培养操作指南1，原代细胞培养原代培养需要严格要求：（1）取材时需要去除脂肪和坏死的组织 （2）为减少对组织的损伤，需用锋利的器具（3）适度离心以去除用于解 离的酶（4）由于原代培养组织细胞的存活率很低，故用于原代培养 的细胞的密度应高于正常的传代培养的细胞密度。（5）营养丰富的培 养基比单一的培养基更可取，如果要添加血清，胎牛血清比牛马的血 清更好。（6）对于取材部位易于感染（如皮肤）应先用70%乙醇消毒， 在无菌条件下切除组织，尽快转移入 BSS 或培养基中。不要再培养 室取材，因为动物可引入微生物污染。若必须推迟，可保存在4C, 72h。1. 剪切组织先将所取得的组织，用 D-Hank
2、s 或 Hanks 液清洗，以去除表面 血污，并用手术镊去除粘附的结缔组织等非培养所需组织。再次清洗 后，用手术剪将组织剪成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加 入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约 1mm3 大小。静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液 再清洗一次。2. 消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。 3.培养细胞悬液用计数板进行细胞计数，用培养液将细胞数调整为2 5x105 cells/ml,或实验所需密度。分装于培养瓶中，使细胞悬液的 量以覆盖后略高于培养瓶底
3、部为宜。置CO2培养箱内，5%CO2, 37C 静置培养。一般35d，原代培养细胞可以粘附于瓶壁，并伸展开始 生长，可补加原培养液量 1/ 2 的新培养液，继续培养 23 d 后换液， 一般 714 d 可以长满瓶壁，进行传代。注意事项：1. 无菌操作 细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强 各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般是很难消除。2. 培养液所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。 由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的 差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。3. 小牛血清 小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增 殖起着关键
4、性作用。可选择多种不同批号的小牛血清进行小样分析。 一旦确定某一厂家的某一批号小牛血清后，就保持应用至实验完成。4. 胶原酶溶液 必须新鲜配制，贮存时间过长（即使是-20C低温 保存），也将影响消化效力，导致消化时间过长，细胞损伤增加。5. L谷氨酰胺几乎所有细胞对谷氨酰胺都有较高的要求，细胞 需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞会因生长 不良而死亡。谷氨酸胺在溶液中很不稳定，加有谷氨酰胺的培养液在4 C冰箱贮存两周以上时，就应重新加入原来量的谷氨酰胺。6. 静置培养 原代细胞在消化分离后，置于 CO2 培养箱的头24-48h （必要时72 h）内，应处于绝对静置状态，切忌不时
5、地取出培养 瓶观察生长状况，这将使原代分离细胞难以贴壁，更谈不上伸展和增 殖。这对初学者尤应注意。不必担心培养液中的营养成份会消耗光， 在细胞增殖之前对营养的要求并不大。原代培养初期仅加一薄层培养 液的目的也在于有利于细胞贴壁伸展。7. 消化时间 一般消化至肉眼尚可见微小组织颗粒即可，因为此 时组织颗粒已经松散，略经吹打即成细胞团或单个细胞，过久的消化 往往导致细胞损伤加重，细胞培养成活率降低。8. 其它生长因子经过以上处理，一般原代分离细胞培养均可以 成功。对于少数特殊类型细胞也可以考虑加一些特殊的生长因子。如 胰岛素能促使细胞摄取葡萄糖和氨基酸。另外，内毒素、EGF、FGF 等均有促有丝分
6、裂作用，但费用较高。原代外植（组织块培养）简介：组织切碎并清洗，组织块接种于培养瓶或皮氏培养皿的表 面，加入少量含高浓度血清（40%-50%）的培养基，表面张力使标本 保持原位，直到他们自发地贴附于表面，随后细胞开始生长。此方法 适合小量组织培养，如皮肤活检组织，为了尽可能减少细胞损失，而 不用酶或机械方法。操作流程：切割-细切-沉淀清洗-清洗后用吸管转入培养瓶- 倾斜培养瓶吸出平衡盐溶液然后加入一薄层培养基培养2-3w,无菌材料：培养基（DMEM与F12等体积混合，再加20%胎牛 血清）；100ml的DBSS;9cm皮氏平皿，非组织培养级别；尖头镊子， 尖头手术刀； 100ml 广口移液器；
7、 15 或 20ml 离心管； 25 平方厘米 的培养瓶或 5 厘米的皮氏培养皿，大约 100mg 组织用 5 个 25 平方 厘米的培养瓶。开始每瓶放 1ml 培养基，随后 3-5 天每瓶加至 5ml.操作步骤：1 ，将组织移入新鲜无菌 BSS 浸洗2，移入第 2 个培养皿切除多余组织，如脂肪或坏死组织，用手术刀交叉切成约1mm3的小块。3,用移液管（先用BSS浸润，否则组织块易贴壁）将组织 块移入 15 或 50ml 离心管或普通容器中，让组织块静置沉淀。4，用 BSS 重悬冲洗组织块后静置，去除上清液，重复两次 或更多5，将 20-30 个组织块接种在 25 平方厘米的培养瓶内（记 住湿
8、润移液管）6，将培养瓶静置放置一会，待组织块沉下去，然后稍微倾 斜吸出液体，然后以每25 平方厘米生长面加入 1ml 的培养基，缓缓 倾斜培养瓶让组织块均匀分布于生长面上。7，盖上瓶盖，放到37C培养箱中18-24h.8, 如果组织块已经贴附，则可在未来 3-5 天内将培养基加至5ml.先预温，以后每周更换一次，直到细胞已生长9，外植块可以自生长中心用镊子取出，用预先浸洗的移液 管移入新的培养器皿中，然后盖上盖子，再继续培养。10.更换第一瓶的培养基直至细胞生长超过生长面积的一半， 此时细胞可以传代。总结：此种方法贴壁率很低，但是可用通过一些方法进行改进。如在 外植物的上方放一块盖玻片，或将外
9、植物置于盖玻片的边缘，2 酶的解离消化组织中细胞与细胞之间的粘附是依靠多种相互作用的同类糖蛋白分 子，其中部分粘附分子具有钙离子依赖性（钙粘素），故对 EDTA 较 为敏感，螯合素含有钙离子结合结构域，可结合到细胞外机制中的 RDG 序列。细胞间基质和基底膜中含有其他糖蛋白对蛋白酶较为敏 感；选择消化液最容易的方法是从单一的消化液入手，过渡至复合的 消化液，开始用胰蛋白酶或胰蛋白酶/EDTA的混合物，后加入其他蛋 白酶促进消化。由于新生和成年动物细胞经开始分化，纤维结缔组织 及细胞外基质增多，未分化的增殖细胞减少。对组织进行分离时，损 害愈严重（长时间的胰酶消化，搅拌），组织越易被破坏成碎片，
10、为 了保持最大活性，无论酶的纯度如何，应该最大限度的减少胰蛋白酶 对细胞的作用时间。当整块组织在37C的胰酶中消化时，已分离的 细胞应每隔半小时收集一次，胰蛋白酶经离心去除，再以含血清的培 养基中和。即可以应用冷消化或温胰酶消化。2.1 胰酶的温消化此技术适应于在相当短的时间消化大的组织尤其是整个小鼠胚胎或 鸡胚。由于成年组织有大量纤维结缔组织，故成年组织不用此法。较 敏感的细胞如上皮细胞也不用此法。无菌材料：组织1-5g,DBSS50ml,用PBSA或正常生理盐水配制 的2.5%粗制胰酶；PBSA 200ml,含血清的生长培养基（DMEM/F12 加 10%胎牛血清）；培养瓶，每克组织 5-
11、10 个（根据培养的细胞不同 而改变）； 9cm 皮氏平皿，非组织培养级别；两个 50ml 离心管； 250ml 锥形瓶；磁力搅拌子在试管中高压消毒；弯头镊子，2ml,10ml移液 管。非灭菌材料：磁力搅拌器，细胞计数板操作步骤：1，将组织块移入加有新配制的无菌 DBSS 皮氏培养皿中， 清洗2，转入另一培养皿，切除多余组织如脂肪或坏死组织，用刀 切成约 3mm3 小块3,用弯头镊将组织移入15ml或50ml无菌离心管或容器中, 让组织块沉淀4，用 DBSS 清洗组织块，组织块沉淀，去除上清液，如此 反复 2 次以上。5，将组织块转入一个空的锥形瓶中，去除多余液体，然后加 入 180ml 的
12、PBSA，6, 加入2.5%的胰酶20ml。以使胰酶最终浓度为0.25%7, 在锥形瓶中加入搅拌子8, 封住锥形瓶,放到搅拌器上,在 37 摄氏度温箱内搅拌9,每分钟 100r, 30min10,30min 后，收集解离的细胞: 让组织块沉淀； 吸出上清 液,置入离心管中,放在冰上,向锥形瓶中加入新的胰酶溶液消化剩 余的组织块,继续搅拌并孵育 30min; 收集的细胞悬液以 500g,5min 离心；用10ml含血清培养基重悬细胞团，储存于冰浴中。11 ,重复第 10 步的过程直至消化完全为止（大约 3-4h）12, 收集冷的细胞悬液，用血球计数板进行细胞技术，并检 测细胞活性13，将细胞悬液
13、用培养基稀释，使每毫升培养基含有1 x 106 个细胞。接种到培养瓶中，大约每平方厘米为2 x 105个细胞。但是 对于存活率不明确或难以预知时，细胞计数无价值。此时建议每毫升 5-25mg 组织的浓度接种。14,每隔2-4天更换一次培养基（以PH下降为标准）。由于 部分细胞粘附较慢甚至易于悬浮生长，所以更换上清液前要先检查上 清液中存活的细胞。总结；此方法应该把握时间，减少对细胞的损伤。可以通过如下简单方法来减少细胞的损害：在4C将组织浸入胰酶，胰酶此时活性很小 的条件下浸透组织，然后放在37C,在很短时间即可将组织消化。2.2 胰酶的冷消化无菌材料：培养基（DMEM/F12，含10%胎牛血
14、清）；DBSS;0.25% 粗 制 胰 酶 溶 于 无 血 清 的 RPMI1640 或 MEM/Stirrer salts（S-MEM）中；9cm皮氏平皿，非组织培养级别；直头，弯头镊 子；剪刀；25ml螺口锥形瓶；25cm2、75cm2培养瓶；2ml,10ml移 液器非灭菌材料：冰浴 操作步骤：1, 将组织移入加有新配制的无菌DBSS的皮氏培养皿中， 清洗。2，转入另一培养皿中，切除多余组织如脂肪和坏死组织，用手术刀细切成大约3mm3的小块，对于胚胎器官若小于3mm3可以 全部保留3，用弯镊子将组织块移入15ml或50ml无菌离心管或普 通容器中，让组织块沉淀4，用 BSS 重悬冲洗组织块
15、，沉淀后去除上清，重复此步骤 2 次以上5，去除剩余液体，每克组织加入10ml溶于RPMI1640的0.25%胰酶，置于4C。6，在 4C放置 6-18h,7,小心去除胰酶，余下组织及残余胰酶（若需要此时可以加 入 1-2ml 其他酶）8,37C，放置 20-30min9,加入温培养基，大约每100mg初始组织加1ml，轻轻吹 打混合物至组织完全分散开。10，若部分组织未分散，细胞悬液可以用无菌的平纹纱布或 不锈钢（100-200 微米）或 falcon 70mm 细胞滤器进行过滤细胞。如 果有较多的组织时，可在每克组织多加入20ml培养基促进沉淀和随 后的悬液收集，通常2-3min就足以去除
16、大多数的大块组织。11，用血球计数板测量并定量细胞密度12，将细胞悬液用培养基稀释，使每毫升培养基含有 1 x106 个细胞，接种培养瓶中同上要求。13，隔 2-4天更换一次培养基（以 ph 下降为标准）。由于 部分细胞粘附较慢甚至易于悬浮生长，所以更换上清液前要先检测上 清液中的存活细胞。总结：与温消化相比，冷消化可以获得较高的细胞存活率， 24h 生存率。可保留更多的细胞种类。但是不适合大块组织（大于 10g）, 可以用于小鼠胚胎的上皮细胞，胚鼠的肝脏血细胞培养。2.3 细胞传代时，细胞与培养皿的分离（1）传代时应检测细胞活力，活力好的细胞应该密度小，活力 差的细胞应该密度高些。（2）吸出过多的细胞培养基，用不含有钙
