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1、 斑点叉尾天然单链(ScFv)噬菌体抗体库的构建及初步鉴定摘要：以健康未经免疫的斑点叉尾为试验材料，取其新鲜外周血，分离淋巴细胞，提取总，逆转录合成。扩增重链和轻链，以纯化的、基因为模板，以与基因端和基因端序列互补的 为引物，将、随机拼接为。通过酶切连接，依次将产物插入质粒相应位点，热激法转化大肠杆菌，加入辅助噬菌体 ，构建噬菌体单链抗体库。测定库容并酶切鉴定。斑点叉尾天然单链（s）噬菌体抗体库成功构建为进一步筛选特异性抗体及从斑点叉尾病变组织中提取特异性抗原用于免疫治疗奠定了基础。关键词：斑点叉尾；抗体库；噬菌体展示；抗体单链（s）construction and preliminary i
2、dentification of single-chain antiboly library ofnatural phage in channel catfish， ietalurus punetauswang hui1，zou shi-ping2（1. college of fisheries，huazhong agricultural university，wuhan 430070，china；2.yangtze river fisheries reserch institute，chinese academy of fishery sciences，wuhan 430223，china）
3、： l ， ， s i d ： ； ； ； s斑点叉尾（ ）亦称沟鲶（ ），属于鲶形目（）科（e）鱼类。主要分布于美国中部、加拿大南部和大西洋沿岸的部分地区。斑点叉尾是水产养殖业中最为重要的养殖鱼种之一，自世纪年代引进我国以来养殖规模不断扩大，出口量也在逐年上升。但是由于斑点叉尾种质资源退化严重，养殖技术较低，养殖环境恶化等原因，导致人工养殖的斑点叉尾病害频发，给养殖业带来巨大损失。斑点叉尾疾病防治应当坚持“预防为主，防重于治”的原则。噬菌体抗体是指采用基因克隆技术将细胞全套可变区基因克隆出来，通过与噬菌体衣壳蛋白基因连接，以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的抗体分子。用淋巴细胞全套抗体可变区基
4、因克隆并组装成的噬菌体群体称为噬菌体抗体库。该技术克服了单克隆抗体杂交瘤细胞中抗体不稳定、容易丢失的弊端，直接利用抗原从抗体库中筛选特异性抗体2-4。本实验室采用未经免疫的健康斑点叉尾外周血单个核细胞（）为基因来源，建立斑点叉尾天然单链（s）噬菌体抗体库。构建的主要目的是为后期筛选抗原特异性抗体打下基础，筛选出的抗体主要用于斑点叉尾疾病早期的抗体诊断试剂盒，从而更有效地对斑点叉尾疾病进行防治。 材料与方法 材料淋巴细胞分离液购自上海超研生物科技有限公司；提取纯化试剂（）、逆转录试剂盒、 聚合酶、购自公司； 连接酶购自公司；限制性内切酶、 载体及试验所用培养基均购自北京盈信阳光生物技术有限公司；
5、凝胶回收试剂盒，质粒纯化试剂盒均购自鼎国生物公司。宿主菌，由本实验室保存；辅助噬菌体 ，来自武汉生物制品研究所；载体，由海军总医院王琰教授惠赠，由本实验室保存。引物序列：（）：（）： （）： （）：（）： 试验方法）淋巴细胞的提取和纯化。通过尾静脉从未经免疫的多条斑点叉尾抽取外周静脉血共 ，常规方法分离。洗涤计数后，每个细胞加 提取总，经异丙醇沉淀，乙醇洗涤后溶于 水中，取适量做琼脂糖凝胶电泳，鉴定质量，并用紫外分光光度计测定浓度，其余保存于 。）逆转录和扩增段及链基因。以 为引物，按照产品说明书，将逆转录为。分别用轻链，重链引物（、）进行扩增。 预变性 ； ， （不同引物组合退火温度不同，波
6、动于 之间） ， ，个循环； 延伸 。）以纯化的、基因为模板，以与基因端和l基因端序列互补的为引物，进行重叠延伸反应， 的， ， （ ）， ， 去离子水，总体积 ，反应条件为 ， ，共个循环，将、随机拼接为单链（）。）单链（）产物经过电泳，回收，纯化，连接载体，然后转化b，提取质粒后，经和双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的条带。将表达载体p用同样的两个酶进行酶切，用琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，再与已经回收的轻链片断进行连接反应（产物 ，线性载体）， 连接过夜。次日加入 超级感受态，进行热激转化（冰浴 ， 热激 ，冰浴 ）。转化反应结束后立即加入 预热到 的培养基， ， 振荡 。加入 培养基（含 和
7、 ）。取部分菌液铺琼脂平板，计算库容。）上述菌液加入培养液振荡 后，加入辅助噬菌体 约 p，混匀后加入 培养基，继续振荡培养 ，之后加入至 ， 振荡过夜。次日 ， 离心 ，得到上清液，加入聚乙二醇 及使两者的终浓度为 和 。振荡促溶，冰浴 ， 离心 ， 。弃上清液，用 悬浮噬菌体沉淀， 离心 ，除去残留的细菌碎片。收集上清液，加入至 ， 保存。至此，用重组的方法，将单链基因（）组合到了噬粒载体，即为噬菌体表面呈现文库 。）将适量、分别溶解于 p 的碳酸盐缓冲液中，包被无菌板， 孔，置于无菌小湿盒 过夜。次日用洗板次后用 封闭 ，弃封闭液，同上洗涤，干燥备用。）取等体积 与库菌液混合， 孵育 。
8、取包被孔孔，加入上述混合液 孔， 孵育 ；同时接种 大肠杆菌于 中， 振荡培养至对数生长期。弃去孔中的液体，用 孔 （ ）洗涤，过程中用移液器反复吹打，重复洗涤次，每次 。然后加入 孔甘氨酸盐酸洗脱液（p ）， 孵育 ，再加入 孔 中和，之后将液体转移到 无菌离心管中，加入 新鲜制备的大肠杆菌， 孵育 ，分别取 、 、 涂平板（amp 50 ，tet 10 ）， 培养过夜，计数菌落数，测定转化率。其余菌液全部转入 培养液（ ）中，加入 ，振荡培养 ，再加入 ，继续振荡培养 ，然后再转入 培养液（ ， ）中继续培养 ，加入约 p辅助噬菌体 ， 继续培养 ，再加入卡那霉素终浓度至 l， 振荡培养过夜。， 离心 ，收集上清液，加入 和 ， 摇床促溶 后冰浴 ， 离心 ， 弃上清液，倒置离心管 沥干残液，加入 含的重悬沉淀，
