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1、荧光实时定量PCR引物设计 I靶的选择和试验设计1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT-PCR的扩增引物,探针以及反应条件.RTPrimerDB (http:/medgen.ugent.be/rtprimerdb), 相对物种较多PrimerBank (http:/pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html) 人，鼠Real Time PCR Primer Sets (http:/www.realtimeprimers.org) 人，mouse，rat如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考,以下的设计方案仅供
2、参考:A.最广泛使用的商业化的软件Beacon Designer(http:/)B.DIY的软件Primer ExpressC.如果Beacon Designer 无法得到您说需要的结果,或者获得到设计方案的备选数目不够的话,可以选择Sigma-Genosys http:/)的服务方案,详细周到D.一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序: http:/ 个碱基GC含量:50%左右如果引物的与AT区域富集结合,可以考虑用LNA替换几个碱基,较少引物的长度以及避免引物次级结构和3端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争,分之内杂交,倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合
3、效率达降低,因此我们选择引物二聚体的G为负值,即:10 kcal/mol.没有连续的G/C.引物探针的保存一般遵循以下原则:正向和反向引物保存在-20度, 浓度为10mM 或者10工作浓度.探针应该避光保存，贮存在-70度,最好以冻干粉状态，工作浓度的液体保存一般两周左右。2.输入靶序列，用BLASTn在http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast进行比对3.检查比对序列的多态性以及可能的错误避免这些区域来进行引物和探针设计4.在靶序列中避免直接待重复区，在重复区进行杂交容易使得引物非获得产物性结合，降低DNA的扩增效率以及减少分析的灵敏度。5.考虑到潜在的剪接变异体以及合
4、适的所需要的获得到靶，通过学分析内含子以及外显子的边界，主要通过cDNA和基因组序列比对来确定。一般都设计跨最长内含子区，这样减少了扩增子受到基因组DNA的污染的影响。这是十分有必要的，特别当用DNA做归一化处理以及靶向某一特异的剪接变异体。最经济的做法是让下游引物跨越剪接接头，这样允许使用一条探针检测可能剪接变异体.然后如果在有效性和灵敏度无法保证情况下，可以使用跨越单一外显子的设计方案。我们还是建议试验者用DnaseI处理样品，除去gDNA的污染。6.在RT步骤时，用(http:/www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/rna/form1.cgi)工具
5、检测在特定温度下靶序列的折叠情况，避免一些高度次级结构的区域，那些区域探针和引物结合效率较低7.尽可能用60-150bp的扩增产物，GC含量在60或者稍小来确定高效的变性，更高度反应效率。GC含量高度序列容易产生非特异性的反应，短序列扩增是的扩增时间缩短gDNA污染可能性减少。短的序列容易人工合成，用来做扩增多标准曲线。用oligodT进行逆转录最好设计扩增子位于靠近模板的3区域我觉得对已知的基因序列要求并不严格，你要扩增的就是这个序列了，是没有办法改变的。至于根据你的基因序列当然可以设计引物了。首先看你的荧光定量是用的什么方法。荧光定量PCR分为以下几种：荧光染料直接与产物结合1.SYBR
6、green 特异性结合双链，释放荧光信号 荧光标记探针1.Taqman双荧光标记探针2.molecular Beacon荧光标记探针3.荧光标记杂交双探针所以说不同的方法设计稍有区别，但是基本原则都差不多：以下列出18条原则，可供参考：首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length）、产物长度（product length）、序列Tm值(melting temperature)、G值(internal stability)
7、、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）、错误引发位点（false priming site）、引物及产物GC 含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。以使用Oligo 软件分析设计引物为例，有以下一些要点：1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，即Taq 酶的最适温度。2.引物3端的序列要比5端重要。引物3端的碱基一般不用A（3端碱基序列最好是G、C、CG、GC），因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3端的互补、二聚体或
8、发夹结构也可能导致PCR反应失败。5端序列对PCR 影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。3.引物的GC含量一般为40-60%，以45-55为宜，过高或过低都不利于引发反应。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。如果G-C比例超出，则在引物的5端增加As或Ts；而如果A-T比例过高，则同样在5端增加Gs或Cs。但也有认为：原来普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率的观点其实是不对的，以人基因组DNA为模板，用81%AT的引物可以产生
9、单一的、专一的、长250 bp，含有70% AT的产物。完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。4.引物所对应模板序列的Tm 值最好在72左右。（Tm 值曲线以选取72 度附近为佳，5到3的下降形状也有利于引物引发聚合反应），至少要在5580之间5.G值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的G值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间G值较高，而3端G值相对较低，且不要超过9（G值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。3末端双链的G是02 kcal/mol时，PCR产量几乎达到
10、百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在6时只有40%、到8时少于20%、而10时接近于0。6.可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出非目的产物的假带。但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130，并且不好找其他更合适的引物，那么这对引物也是可以接受的。7.Frq 曲线为Oligo6新引进的一个指标，揭示了序列片断存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用Frq 值相对较低的片断。8.引物二聚体及发
11、夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR 正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3端的连续GGG 或CCC 会导致错误引发。二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。虽然有些带有发夹环，其G为3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在5末端对反应就没有多大的影响了。9.以公式(4G/C + 2A/T5)计算Tm值，即退火温度。选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的
12、退火温度。4-6的差别似乎对PCR产量影响不大。最好，保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75范围内10.要知道，更重要的因素是模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异。差异越小，PCR的效率越高。因为DNA的解链温度也取决于它的长度，所以有的研究者喜欢设计很长，而不求它很稳定的引物。可是，引物太长就难以避免形成二聚体和自身互补，因此，一般还是不用为好。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(1618 mer)的引物：若产物长5 kb，则用24 mer的引物。有人用2023 mer引物得到40 kb的产物。11.在DNA测序和PCR中最好用5末端稳定(如GC含量较多)，而3末端不
13、太稳定(如AT含量较多)的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。这就是基于引物内部稳定性的经验之谈。其3末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或在3末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA合成，所以不会产生假产物。因此，为了有效地引发反应，引物的5末端和中央部分必须与靶DNA也形成双链。与此相反，带有稳定的、GC丰富的3末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对，只凭借其3末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应，产生非专一产物。无论如何，寡核苷酸3末端最后5个核苷酸的稳定性小于9 kcal/mol的，通常就是专一性的探针或引物
14、。寡核苷酸3末端越不稳定，假引发的可能性越低。12.如果用3末端低稳定性的引物，反应的最适退火温度范围会不寻常的宽。这就可以不经过事先的最佳化实验就能在最佳条件下进行反应。13.引物的唯一性：为了放大单个的、专一性DNA片段，选用的引物序列就应当是唯一的，即在模板中没有重复序列。如果用哺乳动物基因组序列作为模板，可以用Alu序列或其他短重复元件来核对想用的引物的互补性。由此也可知，应当避免使用同寡聚物(如AAAAAA)和二核苷酸重复(如ATATAT)。14.引物和产物的Tm值不要相差太大，20摄氏度范围内较好。定下引物的Tm值范围之后即可定下引物的长度范围。15.对引物的修饰一般是增加酶切位点
15、，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。16.值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件较差，比如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；有时PCR产物要作为克隆对象插入到载体中表达，因此PCR引物设计的可选择度很低。遇到这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件，这时，使用自动搜索引物及正确地评价引物可使研究人员对实验心中有数。17.在设计克隆PCR引物时，引物两端一般都添加酶切点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低，这种PCR需要灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。18.如扩增出多条带（引发错配所致），不出目的带或出目的带很弱（引物引发效率低下）
