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1、生 物 工程 学 报 3 (3 ) : 16 。一 1 7 2 , 2 9 5 7C H 玄;ze seJo “r 几a 乙o f B 畜。亡e e 九托。工og y单克隆抗体亲和力的测定及其意义金 建 平(第 四 军医 大学,西安 )随着单克隆抗体 杂交瘤技术 日 益 广泛 的 应用 . 需要 对获得 的单克隆抗体 (M c A b) 进行系统 的分析鉴定, 以确定其在各种免疫学试验中的价 值。 除 了 对M c A b 的免疫 球蛋白链理化性质、 结合抗原的特异性以 及检测抗原 时 的敏感度进 行分 析外, 测定 M c A b 对 特定抗原的结合亲和力 , 对选择合适 的 M c A b
2、 用于 某一特定的目的是十分重要的。抗体 亲和 力是指一 个抗体分子 与一 个半抗 原分子或抗原分子 的一个决定簇 起反应的能力。 由抗体 (A )b 与半抗原 (H ) 所形成 复合物 (A 卜 H ) 的解离平衡常数表示 : K = A b H / A 酌 H , 单位为升/克分子 。 亲和 力常数 K 越高 , 抗体结合半抗原的能力越强。 抗体亲和力取决于抗体对位 (P ar at o p e) 与 所 作用 抗 原表 位(E Pi to Pe ) 之间的配合程度 (接触面积 的大小、 吻合 的密 切程度以 及带电基 团 与疏水基团 的分 布等) 。 由于 传统方碧制 出抗血清中的抗体是
3、 含有许多不同亲和力抗体组分的混合物, 故对其只能测 出抗血 清对某一半抗原的平均亲和力。 而对大分子蛋白质抗原 , 由于 存在多个抗原决定簇 , 只能测出抗血 清中抗体对抗原分子上全部决定簇的反应 能力 , 称之为 亲合力或活度(A v sd it y ) 川 。M e A b 的高度均一性 ,才使得能够实际测定抗原 一 抗体反应的真实亲和 力, 并使 “ 亲和力” 和 “ 活度” 这两个概念的区分更加明确。 本文旨在 就较常用;的 M c A b 亲和 力测定方 法及其意义 作-简要回顾 。测定单克隆抗体亲和力常用的方法(一) 平 衡透 析法对作用于小分子半抗原 的 M c A b , 利
4、用 小分子能透过 半透膜的特点, 可用本 法测定亲和力。 将一定量的M c A b 和 半抗原分别置于由半透膜隔开的透析小室 两 侧 , 使半抗原分子透入 抗体室 , 与 抗体发生结合反应。 当 A b 十 H 二之 A b H 反应达 到平衡时 , 分别测 定游 离与结合 半 抗 原 的 浓度 ,由修改的S IsP 方程式计算亲和常数:1八b 二 1 / K xl / A b xl/ H +l / 八b 。式中 酌为 结合半 抗原 的克分子浓度;H 为 游离半抗原 的克分子浓度; A 句为抗体结合位点的浓度, 等于 抗体克分子浓度 x 抗体结合价 (Ig G = 2 , x8 M = 1 0
5、 ) 。若 改变反应 物的浓度,用 1 / 酌 对 1/ H 作图时 , M c A b 所得到 的结果应为一条直线 , 可验证 M c A b 亲和 力的均一 性 “ 。在抗体 总浓度未知时,可用相 同浓度 的M c A b 对 两个不同浓度 的半抗原作平衡透析,这时两次透析的平衡常数 分别 为 :( 1 ) x 二 b J / ( A b 二 一 b , )H , ; ( 2 ) x : = b 2 / ( A 。二 一 台。 ) H , 。本文于1 9 8 6 年 8 月 1 1 日收到。本文承蒙汪美先教授、 金伯泉讲师审 校, 特此致 谢.1 7 0生物工式中酌,、切 : 分别为两次透
6、析的结合半抗原浓度; H : 、 H : 分别为两次透析的游 离半抗原浓度 ; A b 二 为未知的抗体总浓 度。 先由 ( 1 ) 式求出 A 酌 : , 代入( 2 ) 式, 即可求出亲和 力常数K “ 。 当抗原颗粒很大时 (如病毒颗粒) , 也可用能透过抗体 F ba 片段的膜作平 衡透析测定抗体 亲和 力名 。(二) 结合抗原沉淀法将单价抗原与相应 M c A b 一同在溶液中温育, 反应达 到平衡后 , 用 05 % 饱和硫酸 钱或1 5 % 聚乙二醇 (P E G 6 0 0 0 ), 进行 F ra r 氏沉淀 , 将结合与游离抗原分离, 分别测定后 ,再以与平衡透析 时相同的
7、方法计算亲和力常数“ 。(三) 放射免疫法 (R IA )在以上两种方法中, 均可用放射性同位素标 记半抗原来进行测定。 对蛋白质抗原 , 尤其是一些 难以纯化和 定量者 , 可将系列稀释 的定量 M c A b , 与痕量 的放射标记 抗原在溶液中一同温育 (M c A b 必须大大过量), 平衡后铡 定结合 曲线。 根据米一 曼氏动力学原理 , 以 50 % 最大结合处 M c A b 结合价浓度的倒数为 亲和常数K 。 。(四 ) 醉联免痊吸 附试验法(E LI S A )将 M cA b 与定量抗原一同在溶液中温育 , 达到平衡后 , 将溶液移至包被有相同固相抗原 的聚苯乙烯微板中,
8、用常规间接法E L sI A 测定溶液中剩余的游离抗体量,可由测出的吸光度值直接计算 出亲和 常数。 由于E IL S A 测定时仅约01 % 的游离抗体结合到固相上 , 故认为测定过程不引起明显的平衡点移动 。 当所用抗原) 所用抗体量01 倍时, 计算中可对抗体量略去不计 ,计算公 式为 : A 。/( A 。 一 A ) 二 1 + K /a 。 。式中 A 。 为无抗原存在时 的抗 体 E LI S A吸光度值; A 为加入 了克分子 浓度为 。 。 的抗原后的吸光度值, K 为亲和力常数的倒程学报3 卷数。 E L IS A 的敏感度使本法能测出10 一 。M数量级的亲和力常数 ,
9、已满足一 般 测 定 M c A b 亲和 力的需要。 并由于本法可用杂交瘤培养上清或腹水等 M c A b 粗制品 进行亲 和 力测 定, 从而能在融 合后 早期对所获得M c A b 进行亲和力评价 , 决定取舍,这是本法的一大优点。 本法的 另一 优点是无 需对抗原或抗体进行标记 , 故简便易行 ,且防止了 由于标记造成的结构修饰而引 起的测定误差【” 。(五) 相对亲和力测 定方法以上 方法均是侧定 M c A b 在溶液中的固有亲和 力, 测算较为复杂。 并且要求抗原 或抗体中至 少有一者是单价的, 测得的结果才能准确。 故除测定 M c A b 对半抗原的亲和 力外, 最好用 抗体
10、F a b 片段侧 定与大分子抗原的亲和力。 因此 , 实际应用中往 往测定某一组 M c A b 对特 定抗原的相对亲和力较为方便 , 亦足 以指导MI c A b 的用途选择。 有时亦将测得的相对亲和力称为 M c A b 在某一体 系 中的活 度或功能亲和力。 常用侧定方法如下:1 . 定量免疫电泳法: 火箭电泳时火箭形区域 的面积是抗原量 的函数 , 但较高亲和 力的抗原一 抗体反应将产生较高大 的火箭形区 域。 可根据加入系列稀释抗原后的火箭电泳面 积与抗原量作图得到的曲线斜 率, 来评价抗体的亲和力 吕。 根据同样原理 , 进而可更 简便地用反向定量免疫电泳法测定, 以 比较一组
11、M c A b 对同一抗原的相对亲和 力 。 。 根据免疫沉淀反应的要求, 只有当抗原和 抗体均是多价 时,才能用本方法测定。2 . 固相放射免疫法 (S P一 R IA ): 用抗原 (如病毒颗粒或蛋白质 等) 包被 微板,加入系列稀释的定量 M c A b 。 温育至反 应平衡后 , 洗去未结 合 M c A b , 加 放射性同位素标 记的抗小鼠 19 第二抗体 ,3 期金建平: 单克隆抗体亲和力的测定及其意义温育后 洗涤, 将小孔割下计数结合的放射性强 度。 只要 保持包 被抗原量恒定 , 即可按下式计算抗体亲和 力: ( A b B 八乃酌T一 A b B )/ A b 。 =一 n
12、 K 。 式 中 A b B 为结合抗体浓度,A b T 为总抗体浓度, n为抗体结合价 , K 为亲和力常数 t 。 。根据 相同原理 , 也可用E IL s A 来测定M c A b 在 固相测 定系统 中的相对亲和力 。另外可根据定量 系列 稀释 M c A b , 在相同条件下 测定其在hgI接法E L SI A 中的终点浓度, 来 比较一组 M c A b 在固相测定体系中的相对亲和力。 将杂交瘤细 胞培养上 清用双 抗体夹心法E Ll s A 测定其中的小 鼠 19 含量 ,可得出其 中M c A b 的浓度, 测定时的标准 曲线可由已知 浓度的正常小 鼠 19 得出。 在固相法测
13、定 时 , 控 制固相抗原 表位密 度在较低水平, 可使 M c A b 呈 单 价 结合状态, 让亲和力的影响更容 易 表现 出来 ” 。单克隆抗体亲和力测定的意义(一 ) 为 适应不同用途选择单克隆抗体提供依据为保证R IA 、 E IL s A 、 免疫荧光 检测 (I F A ) 等免疫学试 验的灵敏 度 和可 靠性 ,所用抗体对特异 性待测抗原 的亲和 力必 须高于一定的阂值 。 当用特异性抗体进行体内解毒 、 抗 毒或中和治 疗, 用 药物或毒素等偶联于抗体治 疗 恶 性 肿瘤, 以及将放射性同位素等示踪剂偶联于抗体进行活体病灶特异性定位诊断 等情 况下 , 为使效果 确实可靠、
14、毒副作用 尽可 能小, 均需要用 高亲 和力抗体。 而用抗 体偶联于固相进行亲和 纯化抗原 时, 为避免强烈 的洗脱条件造成抗原变性, 则需用中等亲和力的 抗体, 以 便能用较温 和 的条件进行洗脱 l “ “ 。 由 于一般抗血清抗体是亲和 力相差很大的多克隆抗体混合物, 用于上述不同 目的时, 其中相应亲和力的组分将能发挥预期 的作用 。 而用 M c A b 取代多克隆抗血 清 时, 就 必 须对其亲和力进行测定,才能选出合 适者备用 。 另外, 由 于某 些 M c A b 对 某一抗原的特异性亲 和力随环境条件 (如温度 、 p H 、 离子成 分与强 度等)的改变 (甚至很微 小的变化) , 会有很 大的差别 , 故为某一 目的而选择 M c A b 时 , 应采取与 实际应用时条件相仿的方法测 定其亲和力 “ “ 。(二) 杂交瘤触合 成功后早 期 预选M C A b应用 E L IS A 等简便方法, 可在 杂交 瘤细胞系第一次克隆化后 , 即对其 M c A b 亲和力进行测定评价。 迎而可结合制 备 口的, 早期决定取舍, 以 达节约材料、 缩短实验周期。(三) 验证M c A b的均一性根据平衡透析 、 结合抗原沉淀或 R IA 测定亲和 力时
