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1、本 科 生 毕 业 设 计（论文）（ 2015届 ）农业与食品科学学院题 目： 烟草遗传转化体系的建立 学 号： 姓 名： 专业班级： 2015 年 5 月 18 日本科生毕业设计（论文）诚信承诺书我谨在此承诺：本人所写的毕业设计（论文）烟草遗传转化体系的建立均系本人独立完成，没有抄袭行为，凡涉及其他作者的观点和材料，均作了引用注释，如出现抄袭及侵犯他人知识产权的情况，后果由本人承担。 承诺人（签名）： 年 月 日目录本 科 生 毕 业 设 计（论文）封1本科生毕业设计（论文）诚信承诺书封21前言11.1 农杆菌介导法11.2 基因枪法21.3 PEG法21.4 显微注射法22材料与方法32.
2、1 试验材料32.1.1 植物材料32.1.2 菌株和质粒32.2 试验方法32.2.1 农杆菌的制备32.2.2 叶片表面消毒32.2.3 预培养-侵染-共培养42.2.4 特美汀对农杆菌的抑制作用42.2.5 芽分化-卡那霉素浓度的测定42.2.6 根分化42.2.7 炼苗-移栽52.2.8 转基因植株的分子鉴定53结果与分析63.1 农杆菌菌液侵染时间对转化效率的影响63.2 共培养时间对转化率的影响73.3 特美汀对根瘤农杆菌的抑菌效果73.4 卡那霉素浓度对烟草叶片外植体出愈率的影响73.5 转基因植株的分子鉴定84讨论8参考文献9致谢11浙江农林大学本科生毕业设计（论文）烟草遗传转
3、化体系的建立农业与食品科学学院 农学111 吴春盛 指导教师：郑志富摘要：利用农杆菌介导的转化法获得转基因植物,这是研究目的基因功能的一种有效方法。本研究将通过探索农杆菌的浸染时间、共培养时间、不同度浓度的特美汀抗生素抑制农杆菌的效果以及不同浓度的卡那霉素（Kan）影响抗性芽分化等因素对烟草K326叶盘转化率的影响,建立一种稳定、高效的烟草K326遗传转化体系。关键词：烟草；组织培养；农杆菌；遗传转化Eestablishment of a Tobacco Genetic Transformation SystemAbstract: Using agrobacterium-mediated tr
4、ansformation to genarate transgenic plants is an effective way to study gene function. This study was aimed to investigate the factors influencing the efficiency of tobacco leaf disc-based transformation, including the infection time of Agrobacterium, co-cultivation time with Agrobacterium, various
5、concentrations of timentin with inhibitory effects on Agrobacterium growth, and different concentrations of Kanamycin (Kan) affecting differentiation rates of the resistant buds in attempt to establish a robust and efficient genetic transformation system of Nicotiana tabacum L. cv K326.Key words: Ni
6、cotiana tabacum, Tissue culture, Agrobacterium, Genetic transformation1 前言所谓遗传转化，是指通过自然或人工感受态细胞的摄取，将同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA分子)转入受体细胞或组织中，并在后代中表达基因特性的基因转移过程。根据感受态细胞的构建方式，遗传转化可以分为自然遗传转化和人工转化两种，其中，自然遗传转化的感受态细胞的出现是细胞本身在一定生长阶段的生理特性，而人工转化则是在人为诱导的基础上，细胞的结构发生一定的变化而具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA分子直接注入细胞内4。常用的遗传转化方法有如下几
7、种：1.1 农杆菌介导法根瘤农杆菌介导的遗传转化方法获得了第一批能表达外源基因功能的转基因植物。用根瘤农杆菌转化体系获得的转基因植株占到了已转化成功的近200种转基因植株的80%以上4。这种方法具有操作简单、转基因拷贝数低、转化率高、操作成本低等优点5，已受到人们的高度重视，并成为植物转基因研究的主要方法之一。农杆菌属于革兰氏阴性菌种，在基因操作中，常用的两类菌种是根瘤农杆菌（含致瘤Ti质粒）和发根农杆菌（含致根Ri质粒）6。目前，在遗传转化中研究得最广泛且最常用的是Ti质粒，当外植体被根瘤农杆菌感染时，根瘤农杆菌环状Ti质粒上的一部分DNA可以整合到被感染植物的基因组中，且其携带的基因能在后
8、代中稳定表达，但农杆菌本身不侵入植物的细胞12-13。农杆菌介导的遗传转化法的主要过程为：（1）细菌亲近植物的感受态细胞；（2）Ti质粒环状DNA上的相关基因被激活；（3）Ti质粒上的T-DNA被切割并形成T-DNA复合物；（4）T-DNA复合物进入植物细胞；（5）T-DNA整合到植物基因组中并表达14。1.2 基因枪法基因枪法，又称散弹轰击法，它的基本原理是：将携带有外源DNA的微粒，如金粒、钨粒等，在高压作用下高速射人受体细胞或组织。微粒进入细胞或组织后，其携带的外源DNA便可以整合到植物的基因组中并表达，从而实现基因的转化。基因枪法的缺点是转化率低、价格昂贵、整合过程中易发生重排等15。
9、1.3 PEG法PEG即聚乙二醇，是一种多聚化合物，它能与DNA在电荷电场力的作用下形成特殊的复合物，并由植物原生质体的内吞作用直接进入细胞。PEG法对禾本科作物有重要作用，水稻、玉米、小麦、高梁等多种作物的原生质体已用PEG法进行了成功的转化。但要使原生质体分化形成再生植株难度很高，且PEG法在遗传转化中转化效率很低，因此PEG法至今还没有得到广泛应用16。1.4 显微注射法显微注射法是指利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体的细胞质或细胞核中。显微注射中的一个重要问题是受体细胞的固定。显微注射用的微针要求极细，针尖直径以0. 5 m左右为宜，一次注入细胞质中的DNA量约为 109/ mL。
10、该方法转化效率高，在多种植物的原生质体转化率高达60 %以上，如烟草、油菜等17。自1983年比利时根特大学研制成第一例可育的转基因植物以来，现在转基因植物巳扩展到包括根食作物、经济作物、花卉、树木等在内的35个属、120多个物种6。在烟草种植中引入转基因技术已有多年的历史，最初生物学家在某些烟草品种中进行了许多尝试，被整合到烟草中的细菌基因为数不多，在下一代烟草中都继承了这些基因的属性。烟草的组织培养技术简单，且以烟草作为外植体的遗传转化能获得较高的转化率，因此，烟草已经成为遗传转化研究的模式植物。近年来，我国已经有许多关于烟草转基因的研究，研究工序也日趋完善。国内已有成功将甜蛋白基因、人组
11、织型纤溶酶激活剂（t-PA）基因、渗透胁迫相关基因等等导入烟草基因组的研究1-3，转基因烟草给许多烟农带来了可观的收益。 自1996年起，转基因烟草相继引进到国内的许多地方开始种植，并做了许多国内外的贸易。这些转基因烟草的主要特点是，烟草中导入了抗病菌性的基因，这在控制烟草疾病方面非常有效。对农民来说，他们对很少了解转基因烟草的种植信息。但很接受抗病毒的技术在烟草中得到应用。从全球范围来看，转基因作物的种植面积从1995年开始逐步增长，到2002年，全球大约有550-600万亩的烟草种植面积。美国、加拿大、中国、印度、德国等国家都有种植商业转基因作物，其中美国的转基因烟草种植面积达到了全球的6
12、7%，加拿大为6%，中国为4%9。用生物技术种植作物的优势有环境优势、作物的潜在生产、加工者和消费者的利益等20。有人断言：“21世纪将是生命科学的世纪”。这个命题囊括三层意思：；与其他学科相比，生命科学有更显著的发展；与其他学科相比，生命科学对人类社会的进步和科技业的发展有更大的影响；生命科学对其他学科将发挥较大的推动作用10-11。随着现代科学技术的不断创新，我们已经进入了一个以高科技引领生产与生活的时代。在生物学领域，植物组织培养、基因工程等生命科学技术为现代农业生产提供了高效、高产的生产手段，同时，这些技术也为人们研究植物的潜在用途提供了途径，使其在植物育种与繁殖、生物化合物的工业化生
13、产和植物的种质资源保护等方面得到了广泛的应用18-19。植物组织培养是以植物细胞具有全能性作为理论基础的一项植物无性繁殖技术。广义的植物组织培养也叫离体培养，是指从植物体分离出所需的组织、器官或细胞作为外植体，在无菌条件下，接种到含有植物所需营养物质和植物激素的培养基上培养，最终获得完整植株或其他有价值产品的技术。狭义的植物组织培养是指用植物的各部分组织，如叶组织、胚乳等在培养基上诱导愈伤组织，进而继续分化芽和根，最终获得完整组织的技术。在培养过程中，需要根据植物的特性来配制合适的培养基，可以通过加入不同种类和不同浓度的植物激素来使愈伤组织向指定方向分化，同时要控制好光照、温度、湿度等外界条件
14、21-23。近年来，随着分子技术的飞速发展，遗传转化的方法在植物转基因工程中的转化率越来越高，且可以在植物中转入大片段的DNA，表达效果也越来越好，而且，随着简单仪器和操作技术的开发，转基因技术已引起了人们的极大关注8。本研究将以普通烟草品种K326的叶片作为外植体，通过根瘤农杆菌GV3101介导法，将质粒pBI121导入烟草中，经不同浓度的卡那霉素（Kan）帅选，获得Kan抗性植株，其中部分抗性植株的PCR检测呈阳性，为烟草K326建立一个稳定、高效的遗传转化体系。2 材料与方法2.1 试验材料2.1.1 植物材料本试验用的是普通烟草品种K326，将烟草种子放于小布袋中，并置于20左右的水中浸种一昼夜，使种子吸收充足的水分，然后除去多余水分，进行催芽。催芽时，每天翻动种子一次，并用温水冲一次，以洗去种子的代谢物，催芽5天左右种子胚根长出，便可播种到基质培养基中。经正常的浇水、施肥管理约2个月后，可获得本试验所用的烟草小苗。2.1.2 菌株和质粒本试验使用的转化受体菌为根瘤农杆菌GV3101，载体为含卡那霉素抗性基因和目的基因的质粒pBI121。2.2 试验方法2.2.1 农杆菌的制备挑单克隆于10 mL肉汤培养基（LB培养基，Kan的终浓度为50 g/mL）中，在28、转速220 rpm的条件下培养。培养24 h后取80 L菌液转接于10 m
