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1、几种表面活性剂对p-gp底物罗丹明123经肠粘膜透过性的影响李国锋* 2005年广东省科技计划项目(编号：2005B30101007)资助通讯作者：李国锋（1964），男（汉族），江苏江阴人，药学博士，教授，主任药师，博士生导师，两次留学日本研修，主要从事生物药剂学的研究工作， Tel：020-62787724，E-mail：，侯连兵，黄蓓蓓，任非，李青 （南方医科大学南方医院药学部，广州 510515）摘要：目的 观察低浓度表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油，Labrasol和吐温80对肠粘膜p-gp的调控作用。方法 使用体外扩散池法评价罗丹明123 (R123)经空肠，回肠和结肠粘膜的经时经吸收方向
2、和分泌方向的透过量和透过系数（Papp），并测定不同浓度表面活性剂对R123和荧光素钠（CF）经肠粘膜透过性的影响。R123和CF在接受室中的浓度用荧光分光光度法测定。结果 R123经肠道粘膜的透过性存在部位差，即以空肠，回肠和结肠的次序透过性依次减少。另一方面，R123经肠道分泌方向的透过性显著地高于其吸收方向的透过性。低浓度的3种表面活性剂具有增加R123经吸收方向的透过性，减少经分泌方向的透过性，并存在浓度依赖性。但试验浓度的表面活性剂对CF的肠道转运没有影响。结论 低浓度的聚氧乙烯蓖麻油，Labrasol和吐温80可通过对P-gp功能的抑制而用于改善受P-gp介导药物的吸收，有望提高此
3、类药物的口服生物利用度。关键词 P糖蛋白；罗丹明123；荧光素钠；聚氧乙烯蓖麻油,；Labrasol；吐温80；扩散池；透过性Effect of some surfactants on the permeabilities of rhodamine 123, a p-gp substrate across the rat intestinal membranes in vitro LI Guo-feng, Hou Lian-bin，HUANG Pei-pei, REN Fei, LI Qing (Pharmaceutical Department of Nanfang Hospital, So
4、uthern Medical University, Guangzhou 510515)ABSTRACT: OBJECTIVE To investigate the modulation of cremophor EL, labrasol and tween-80 on the permeability characteristics of rhodamine123 (R123) across the different intestinal membranes. METHODS The permeability (Papp) of R123 or fluorescein sodium (CF
5、) via rat intestinal membranes at concentration of 5g.mL-1 was evaluated by an in vitro diffusion chamber system after the membranes were isolated from the intestine in rat, with or without the co-administration of the above three surfactants at different low concentrations. And the concentration of
6、 R123 or CF in the receptor was determined by the fluorospectrophotometry. RESULTS There exists regional difference for the permeability of R123 across the rat intestinal membranes, which means the permeabilities of R123 was gradually decreased from jejunum, then ileum to colon. On the other hand, t
7、he serosal-to-mucosal transport (S-M) of R123 was much greater than its mucosal-to-serosal (M-S) transport. With co-administration of the 3 surfactants at low concentrations, the absorptive directed transport of R123 was significantly increased while its secretory directed transport was decreased, a
8、nd the concentration-dependent effect was also found. However, no action of the 3 surfactants at test concentration was found on the transport of CF across the intestinal membranes. CONCLUSION It maybe possible to improve the absorption of p-gp mediated drugs by co-administration of cremophor EL, la
9、brasol and tween-80 at low concentration, therefore to improve the oral bioavailability of these drugs. KEY WORDS: p- glucoprotein; rhodamine 123; fluorescein sodium; Cremophor EL; Labrasol ; Tween-80 ; diffusion chamber; permeability 60以上的药物通过口服给药的形式发挥其防病治病的作用。药物口服给药后，主要通过小肠吸收进入血液循环，其吸收过程主要分为经细胞途径和
10、旁细胞途径。最近研究发现，许多口服药物生物利用度低的主要原因同存在于小肠粘膜的p-糖蛋白有关。P-gp作为一种能量依赖性药物外排泵，通过ATP供能，将细胞内的药物泵出细胞外，从而降低细胞内的药物浓度1,2。P-gp在肿瘤细胞中的表达，通过主动排出各种肿瘤化疗药物而产生mdr（Multidrug resistance）表型3，4，引起肿瘤细胞耐药性。同样，肠粘膜中的p-gp, 一方面限制了药物的吸收，另一方面可以把药物从循环系统重新排泄到胃肠道 10，这种双重作用是导致受p-gp调控作用药物（p-gp底物药物）生物利用度低的主要原因之一。因此，抑制肠粘膜p-gp的活性是提高这些药物吸收的非常有用
11、的办法之一。本文采用DiffusionChamber实验技术来分析考察底浓度的几种表面活性剂对p-gp的底物之一罗丹明123（R123）经肠粘膜透过的调控作用，试图从无药理活性的药用敷料中优选具有p-gp抑制作用的物质，为进一步开发p-gp抑制剂来提高药物的生物利用度提供一些有价值的实验数据。1 材料和方法1.1 试药 罗丹明123(R123，sigma公司)；荧光素钠（CF, sigma公司)；HEPES (2-4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl ethanesulfonic acid)购于光和纯药（日本）；TRIZMA BASE(Tris(hydroxymet
12、hyl aminomethane)为sigma 公司产品；聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor，sigma公司）；Labrasol来自法国Saint-Priest；吐温80（辽阳奥克纳米材料有限公司）。戊巴比妥钠（上海化学试剂总公司进口分装）；其余所有的化学品均是分析纯。1.2 仪器 扩散池（美国HARVARD APPARATUS，lnc.）；荧光测定仪F-2000 （日本东京HITACHI株式会社）1.3 动物 Wistar雄性大鼠，体重250g30g，由南方医科大学实验动物中心提供，动物实验的方法符合南方医科大学实验动物伦理委员会的有关规定和要求。1.2 实验用药物溶液的配制1.2.1 HE
13、PES溶液的制备 取HEPES 0.6g，溶于80ml蒸馏水中，使之完全溶解。通入混合气体(95%O2:5%CO2) 10分钟后，加入0.18 ml KCl(3 moll-1)， 0.18ml CaCl2(1 moll-1)，0.08 ml MgSO4(1 mmoll-1)，0.818 g NaCl，完全溶解后用Tris溶液(1 mmoll-1)调节pH至7.4，再加入0.5ml葡萄糖溶液(1 moll-1)，用蒸馏水稀释至100ml，混匀即得。1.2.2试验药物溶液的制备 分别将R123或CF溶解在pH 7.4的O2/CO2（95/5）气体饱和的HEPES中，这种HEPES溶液每天制备，实验
14、用R123或CF的最终浓度均为5ug.mL-1。配制含有不同浓度表面活性剂的药物溶液，在评价对R123透过影响的实验中，使用了Cremophor的浓度为0.005%，0.01%，0.05%，0.1%和0.5%，Labrasol和吐温80的浓度为0.01%，0.05%，0.1%，0.2%和0.5%。在评价表面活性剂对CF透过的影响中，使用了Cremophor的浓度为0.05%，Labrasol和吐温80的浓度为0.01%。1.3 荧光分光光度法测定R123和CF的方法 R123的激发波长为480nm， 发射波长为540nm，可以在此波长条件下定量测定若丹明的荧光强度。结果R123浓度在10ng.
15、mL-1200ng.mL-1之间，线性关系良好，R2=0.9999；CF 激发波长为490nm，发射波长为520nm，在试验的浓度200 ng.mL-12000 ng.mL-1之间，线性关系良好，R2=0.9993。1.4 渗透研究 用一种扩散Chamber池实验法，使用离体大鼠小肠粘膜，研究120min内在各种低浓度表面活性剂共存或没有共存时R123或CF经不同肠粘膜的经时透过量的变化。Wistar大鼠，雄性，质量260-280g，禁食16h，用戊巴比妥钠(32 mg.kg-1)麻醉。取出全部肠道组织，用pH 7.4的PBS 冲洗干净。小肠顶部的5cm被去掉，接着的10cm的小肠被作为空肠，
16、最后的10cm被作为回肠。大肠的最初2 cm被去掉，接着的6cm被作为结肠。剥离浆膜侧的浆膜肌层，将肠粘膜固定在扩散室中，扩散室的有效面积为1.78 cm2。一旦肠粘膜被固定好后，即刻在扩散池的粘膜侧或浆膜侧加入已经加热到37.5，pH 7.4的HEPES缓冲液7 ml，而等体积同温度的试验用药物溶液被加入到相反侧。扩散池的两边均通入95% O2和 5% CO2的混合气体，并在37.5恒温来维持肠粘膜的活性。在给定的时间间隔，在接收侧取样1ml，同时立刻补充同温度的等体积的HEPES缓冲液。样品中R123或CF的浓度用荧光分光光度计来测定。1.5 表观透过系数(Papp) 用下列公式计算：Papp=dC/dT*(1/A.C0), 这里Papp以cm.s-1表示, dC/dT是透过曲线直线部分的斜率，A 指扩散面积，C0是药物
