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1、 抗中性粒细胞胞浆抗体在系统性红斑狼疮中的临床意义抗中性粒细胞胞浆抗体在系统性红斑狼疮中的临床意义中华皮肤科杂志 1999年第1期第32卷 论著作者：罗婷赵明辉马圣清单位：罗婷、马圣清(100034北京医科大学第一医院皮肤科)；赵明辉(肾脏内科)关键词： 红斑狼疮；系统性；抗中性粒细胞胞浆抗体【摘要】目的为了探讨抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)在系统性红斑狼疮(SLE)中的临床意义。方法通过间接免疫荧光(IIF)、酶联免疫吸附试验和免疫印迹方法检测了84份SLE患者血清ANCA的阳性率和6种已知的靶抗原：蛋白酶3、髓过氧化物酶、杀菌通透性增高蛋白、弹力蛋白酶、组蛋白酶G和乳铁蛋白。结果间接免疫
2、荧光法检测ANCA在SLE中的阳性率是22.6，均为核周型ANCA；分别有44.1和14.3的SLE患者血清含有抗组蛋白酶G和乳铁蛋白自身抗体，且活动期的阳性率明显高于稳定期。结论组蛋白酶G为ANCA的主要靶抗原，且抗组蛋白酶G抗体与SLE的病情活动有关。Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies and Their Target Antigens in Patients with Systemic Lupus ErythematosusLUO Ting, ZHAO Minghui, MA Shengqing. department of Dermatology
3、, First Teaching Hospital, Beijing Medical University, beijing 100034【Abstract】ObjectiveTo investigate the clinical significance of antineutrophil cytoplasmic antibodies(ANCA ) and their target antigens in systemic lupus erythematosus(SLE).Methods84 serum samples were collected,and indirect immunofl
4、uorescence(IIF) and ELISA were used to detect the positive rates of ANCA and 6 known target antigen, the 6 specific ANCA antigens included proteinase 3 (PR3), myeloperoxidase (MPO), bactericidal/permeability-increasing protein(BPI), human leukocyte elastase(HLE), cathepsin G(CG) and lactoferrin(LF).
5、 Positive sera were furthur studied by Western blot analysis. The positive rate of ANCA was also compared between patients with (n=50) and without (n=34) lupus activities to reveal whether ANCA were correlated with lupus activities.Results22.6 sera showed ANCA positive by IIF method, and all of them
6、 were peripheral nuclear aNCA. However, ELISA testing showed that 44.1 and 14.3 sera recognized CG and LF, respectively. The positive rates of anti-CG, and anti-LF antibodies in patients with active lupus were significantly higher than those in non-active patients (P 0.001).ConclusionThe target anti
7、gen of ANCA in SLE patients was CG, and anti-CG antibodies might be correlated with lupus activities.【Key words】 Lupus erythematosus, systemicAntineutrophil cytoplasmic antibodies抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)是以中性粒细胞和单核细胞胞浆成分为靶抗原的自身抗体。有研究报道在系统性红斑狼疮(SLE)中ANCA有一定的阳性率，但是文献中对靶抗原的报道并不一致，对ANCA在SLE中的临床意义也有争议。为此，我们检测了84份
8、SLE患者血清中6种已知的ANCA靶抗原和阳性率，并且初步探讨了ANCA在SLE中的临床意义。材料和方法一、临床资料84份SLE患者血清采自1992年1月至1997年8月我科就诊的患者。所有病例均符合美国风湿病协会制定的诊断标准。根据Urowitz等提出的狼疮活动性标准分为活动期和稳定期，其中活动期血清50份，稳定期血清34份。58份正常人血清为对照。二、实验方法1.间接免疫荧光法(IIF)：从正常人静脉抗凝血中分离白细胞为底物进行IIF检测。制备底物的方法简述如下：健康人肝素抗凝血10mL，加预冷的4倍红细胞溶解液(0.83 nH4Cl 10mmol/L KHCO3 0.1mmol/L ED
9、TA)。置冰盒10min后离心1500r/min，10min，弃上清液，收集底部细胞层。0.01mol/L pBS洗2次后，置含5胎牛血清的RPMI1640培养液调细胞浓度为106/mL。细胞离心机(Shadon)甩片，纯酒精(4预冷)固定5min，20保存备用。IIF结果判定中性粒细胞胞浆内呈亮绿色荧光，在细胞核核叶之间有重染者为胞浆型ANCA(c-ANCA)；荧光着色环绕细胞核周围则为核周型ANCA(p-ANCA)。2.酶联免疫吸附实验(ELISA)检测ANCA：参照Wiik。6种特异性抗原：蛋白酶3、髓过氧化物酶、杀菌通透性增高蛋白、弹力蛋白酶、组蛋白酶G和乳铁蛋白分别用0.05mol/
10、L碳酸盐(pH9.6)缓冲液(BPI则用0.01mol/L pBS缓冲液)稀释后包被酶标板，终浓度为12g/mL。 2检验比较SLE活动期与稳定期两组患者ANCA的阳性率。3.免疫印迹法测定ANCA：1中性粒细胞粗抗原的制备：参照文献。取健康人的肝素抗凝血200ml，加预冷的4倍红细胞溶解液；4，10min后离心，1500r/min,10min，弃上清液。底部沉淀打匀后，重复上述步骤一次。预冷的PBS缓冲液清洗2次。加0.2mol/L醋酸钠(pH4.2)10mL,PMSF(Sigma)终浓度1mmol/mL。超声细胞粉碎机粉碎细胞(共10次，每次30s，中间间隔30s，冰浴中进行)；4，120
11、00r/min，离心20min；测上清液中的蛋白浓度；将上清液分装入Ependorf管，冷冻干燥，20保存备用。2免疫印迹法：参照文献。结果1.IIF法：84份SLE患者血清，19份阳性，均为p-ANCA，阳性率22.6。2.ELISA法：84份SLE血清中无1例识别蛋白酶3、髓过氧化物酶或杀菌通透性增高蛋白，只有2份识别弹力蛋白，12份识别乳铁蛋白(14.3)，37份识别组蛋白酶G(44.0)。50份活动期血清中，10份乳铁蛋白阳性(20.0)，29份组蛋白酶G阳性(58.0)；而34份稳定期血清分别只有2份乳铁蛋白阳性(5.9)，8份组蛋白酶G阳性(23.5)，经2检验，两者具有显著性的差
12、异(P0.01)。3.免疫印迹法：阳性血清相对分子质量为29 000、78 000的蛋白条带，分别是特异性抗原组蛋白酶G和乳铁蛋白。讨论ANCA是近10年来国际上血管炎研究领域的一大热点。研究表明，不同的ANCA类型和靶抗原往往与临床上不同的疾病相关。虽然有研究报道SLE中ANCA有一定的阳性率，但是对靶抗原和其中的临床意义存在争议。通常用IIF法检测ANCA分为两种类型：胞浆型ANCA，其靶抗原主要是PR3，还有一部分是BPI；核周型ANCA，其靶抗原主要是髓过氧化物酶，还有组蛋白酶G、弹力蛋白酶和乳铁蛋白等。近年来，有关ANCA在SLE中的研究涉及了检测方法、特异性靶抗原、临床意义等各个方
13、面。由于SLE中ANA的阳性率很高，与p-ANCA很难区别。应注意选用淋巴细胞为底物作内参照。ANA不仅可识别外周血单一核细胞，也识别淋巴细胞，而p-ANCA不识别淋巴细胞内的成分。但是，当ANA和ANCA同时阳性时，ANA的荧光很强可掩盖ANCA，与p-ANCA区分很困难。本研究中IIF法的阳性率仅为22.6，明显低于ELISA法。因此应用IIF法检测SLE患者的ANCA仅可作为过筛，要通过ELISA法明确靶抗原。本研究检测了ANCA的6种已知抗原，84份SLE血清无1例识别髓过氧化物酶、杀菌通透性增高蛋白，只有2例弹力蛋白酶阳性，有12例乳铁蛋白阳性(14.3)，37例组蛋白酶G阳性(44
14、.0)，说明SLE中ANCA的靶抗原主要是组蛋白酶G和乳铁蛋白。并且活动期组蛋白酶G和乳铁蛋白的阳性率明显高于稳定期。本组资料未发现ANCA阳性与重要器官如肾脏受累有关；患者病程中出现皮肤血管炎改变与ANCA阳性也无明显关系。本组资料表明，IIF法检测SLE患者血清中p-ANCA的阳性率是22.6，未见c-ANCA；特异性靶抗原主要是组蛋白酶G和乳铁蛋白，组蛋白酶G的阳性率可达到44.0。我们进一步发现SLE病情活动期组蛋白酶G和乳铁蛋白的阳性率明显高于稳定期，提示抗组蛋白酶G和乳铁蛋白自身抗体可能与SLE的病情活动有关。参考文献Spronk PE, Bootsma H, Horst G, e
15、t al. antineutrophil cytoplasmic antibodies in systemic lupus erythematosus. Br J rheumatol, 1996,35:625-631.Schnabel A, Csernok E, Isenberg DA, et al. Antineutrophil cytoplasmic antibodies in systemic lupus erythematosus: prevalence, speceficities, and clinical significance. Arthritis Rheum, 1995,3
16、8:633-637.蒋明, 朱立平, 林孝义主编. 风湿病学. 第1版. 北京:科学出版社,1995.1037.Wiik A, Rasmussen N, Wieslander J. Methods to detect autoantibodies to neutrophilic granulocytes. Manual Biol Markers Dis, 1993;A9:1-14.Zhao MH, Jones SJ, Lockwood CM. Bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) is an important antigen for a
