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1、分光光度法测定DNA的浓度和纯度分光光度法测定DNA的浓度和纯度【目的要求】：认识：分光光度法测定DNA浓度和纯度的原理；掌握：分光光度法测定DNA浓度和纯度的技术方法；熟习：分光光度法测定DNA浓度和纯度的实验操作步骤和注意事项。【实验原理】：前面提取获得的DNA的浓度和纯度都是未知的，在后续的DNA酶切、连结及转变等实验中需要必定的浓度和纯度要求，所以要测定DNA的浓度和纯度。测定 DNA的方法往常有：紫外分光光度法；琼脂糖凝胶电泳法（也叫荧光光度法）（1）紫外分光光度法：构成 DNA的碱基均拥有必定的汲取紫外线特征，最大汲取值在波长为250 270nm之间，腺嘌呤的最大紫外线汲取值在，胞
2、嘧啶： 267nm，鸟嘌呤： 276nm，胸腺嘧啶： ，尿嘧啶： 259nm。 / 这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后其最大汲取峰不会改变，但核酸的最大汲取波长是260nm，汲取低谷在230nm。这个物理特征为测定核酸溶液浓度供给了基础。在波长紫外线下， 10OD值的光密度相当于双链DNA浓度为 50g/ml ；单链 DNA或 RNA为260nm40g/ml ；单链寡聚核苷酸为20g/ml 。能够此来计算核酸样品的浓度。分光光度法不只能够确立核酸的浓度， 还能够经过测定在 260nm和 280nm的紫外线汲取值的比值（ A260/A280 ）预计核酸的纯度。 DNA的比值为， RNA的比值为。若
3、 DNA比值高于，说明制剂中 RNA还没有除尽。 RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将致使比值降低。 270nm存在高汲取表示有酚的扰乱。 自然也会出现既含蛋白质又含 RNA的 DNA溶液比值为的状况， 所以有必需联合凝胶电泳等方法判定有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测能否存在蛋白质。紫外分光光度法只用于测定浓度大于g/ml 的核酸溶液。（2）琼脂糖凝胶电泳法（荧光光度法）：关于很稀的核酸溶液，能够用琼脂糖凝胶电泳法。溴化乙锭在紫外光照耀下能发射荧光，它插入到 DNA分子中形成荧光联合物，使发射的荧光加强几十倍，而荧光的强度正比于DNA的含量， 将已知浓度的标准样品作为电泳比较，就能够预计出
4、待测样品的浓度。用量只要要5-10ng DNA即可，肉眼察看可检测的DNA。该方法不过预计水平，此外还应试虑DNA或 RNA样品中分子大小与标准比较中核酸分子的长度。【仪器与试剂】：主要仪器：紫外分光光度计、石英杯、离心管、微量移液器；主要试剂：实验1 提取的质粒样品、纯水。【重要实验步骤和教课方案】：汲取 5 L DNA样品或 4 L RNA样品，加水至 1ml 混匀后，转入分光光度计的石英比色杯中。假如样品极少，能够用的比色杯，上述核酸样品与水的用量减小一半。先用 1ml 水对分光光度计校订为零点。在 260nm和 280nm 分别读出光密度， DNA样品的浓度我OD260 核酸稀释倍数
5、50/1000 ；RNA样品的浓度OD260 核酸稀释倍数 40/1000 ；浓度单位为g/ L。按步骤1 的稀释方式， DNA或 RNA的浓度（ g/ L）均为 OD260的 10 倍；如 OD260为，则样品的浓度就为 1g/ L DNA 或 RNA。这样稀释倍数特别便于计算。若为DNA样品， OD260/OD280比值大于，说明仍存在RNA，能够考虑用RNA酶办理样品；小于，说明样品中存在蛋白质或酚，应再用酚/ 氯仿抽提， 用乙醚抽提后， 以乙醇积淀纯化DNA。RNA样品OD260/OD280比值小于2，也应当考虑再用酚/ 氯仿抽提。【实验注意事项】：使用石英杯时要注意拿取方法，不要直接拿透光的那两个侧面；丈量前要调零，丈量不一样样品时要冲刷石英杯；正确开、关紫外分光光度计。【思虑题】：实验得出的数据能否合理为何？假如实验测得A260/A280 ，能否能说明提取的DNA样品特别纯净为何
