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1、微生物多糖的研究进展 生命科学技术学院08级2班 杜长蔓摘要: 就微生物多糖的种类，生物合成、提取与纯化、实现了工业化的微生物多糖及其应用进行了综述, 展望了微生物多糖开发利用的前景。微生物多糖主要指大部分细菌、少量的真菌和藻类产生的多糖。微生物多糖由于具有安全性高、副作用小、理化特性独特等优点而使其在食品和非食品工业备受关注,尤其在医药领域具有巨大的应用潜力。微生物多糖在细胞内主要有三种存在形式: 黏附在细胞表面上,即胞壁多糖; 分泌到培养基中,即胞外多糖; 构成微生物细胞的成分,即胞内多糖。而其中的胞外多糖具有产生量大、易于与菌体分离、可通过深层发酵实现工业化生产。一般微生物多糖的生产主要
2、是利用淀粉为碳源,经过微生物的发酵进行生产,也有通过利用微生物产生的酶作用制成的。能够产生微生物胞外多糖的微生物种类较多,但是真正有应用价值并已进行或接近工业化生产的仅十几种。近几年,随着对微生物多糖研究的深入,世界上微生物多糖的产量和年增长量在10 %以上,而一些新兴多糖年增长量在30 %以上。到目前为止,已大量投产的微生物胞外多糖有黄原胶(Xant han gum) 、结冷胶( Gellan gum) 、小核菌葡聚糖(Scleeroglucan) 、短梗霉多糖( Pullulan) 、热凝多糖(Curdlan) 等。微生物多糖和植物多糖相比较具有以下优势:生产周期短,不受季节、地域、病虫害
3、等条件的限制; 具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景; 应用广泛,例如已作为胶凝剂、成膜剂、保鲜剂、乳化剂等广泛应用于食品、制药、石油、化工等多个领域。据估计,目前全世界微生物多糖年加工业产值可达80 亿左右。关键词: 微生物多糖; 生物合成; 提取与纯化;开发应用0引言多糖是一种天然的大分子化合物，来源于动物、植物及微生物，在海藻、真菌及高等植物中尤为丰富。它是由醛糖和（或）酮糖通过糖苷键连接成的聚合物，作为有机体必不可少的成分，同维持生命体机能密切相关，具有多种多样的生物学功能。根据多糖在微生物细胞内的位置，可分为胞内多糖、胞壁多糖和胞外多糖。人们对多糖的初始研究可追溯到1936 年She
4、ar对多糖抗肿瘤活性的发现, 但微生物多糖倍受关注是从20 世纪50 年代开始的. 20 世纪50 年代, J eanes等人筛选、获得了许多黄原胶(Xan than gum ) 的产生菌. 1964 年, 原田等人从土壤中分离到产凝结多糖(Cu rdlan, 又称热凝多糖) 的细菌, 后发现农杆菌(A grobacterium sp. ) 也可以产生该多糖. 1978 年,美国人生产制造了产生于少动鞘脂类单胞菌(S p hing om onas p aucim obilis, 旧称伊乐藻假单胞菌) 的结冷胶(Gellan gum , 又称胶联多糖). 随后, 小核菌葡聚糖(Scleerogl
5、ucan)、短梗霉多糖(Pu llu lan, 又称普蓝)、透明质酸( Hyalu ron ic acid)、壳聚糖(Ch i2tasan) 等微生物多糖又相继被人们发现.近年来又兴起一些新型微生物多糖如海藻糖、透明质酸、壳聚糖等的研究。微生物多有广泛的应用价值, 已作为乳化剂、增稠剂、稳定剂、胶凝剂、悬浮剂、润滑剂、食品添药品等应用于石油、化工、食品、医疗、制药保健等多个领域1 . 为了不断开发微生物多糖的潜能, 仍然需要筛选、分离新的多糖产生菌, 了解多糖的生物合成, 研究它们的结构、理化学特性,进一步拓展它们的应用领域.1微生物多糖的生物合成多糖有的合成于微生物的整个生长过程, 有的合成
6、于对数生长后期, 而有的则合成于静止期. 它们种类繁多, 可分为同型多糖和异型多糖, 都是由相同或不同的单糖或者和其它基团在特定的酶催化下聚合而成, 但异型多糖如黄原胶、结冷胶的合成比同型多糖如右旋糖苷、果聚糖的合成复杂得多. 异型多糖的合成体系包括五个基本要素: 糖基- 核苷酸、酶系统、糖基载体脂(十一聚类异戊二烯醇磷酸脂)、糖基受体(引物) 和酰基供体, 其中的糖基- 核苷酸为微生物提供活性的单糖并通过差相异构、脱氢、脱羧等反应提供多种单糖.1. 1微生物多糖生物合成模式细菌胞外多糖的合成有两种模式: 依赖于糖基载体脂的合成模式和不依赖于糖基载体脂的合成模式. 依赖于糖基载体脂的合成模式:
7、 单糖进入细胞后形成糖基2核苷酸, 糖基2核苷酸将糖基顺序转移到糖基载体脂或在其上形成寡糖重复单位. 然后糖基载体脂将糖基运往膜外释放, 再在酶的作用下和受体聚合成胞外多糖. 革兰氏阴性菌合成的多糖(如黄原胶、结冷胶等) 都属于这种模式2 .不依赖于糖基载体脂的合成模式: 单糖不进入细胞, 它们在胞外酶的作用下直接聚合底物中的糖基为胞外多糖. 合成过程中不需要糖基- 核苷酸、糖基载体脂等物质. 肠膜状明串珠菌合成的右旋糖苷就属于此种模式.1. 2微生物多糖生物合成途径L igio 等3 提出了由少动鞘脂类单胞菌(S p h in2g om onas p aucim obilis) 合成结冷胶的
8、可能途经， 提供糖基核苷酸的活性前体为UDP2葡萄糖、TDP2鼠李糖和UDP 2葡萄糖醛酸, 它们也是重复四在野油菜黄单胞菌(X an thom onas campestris)生物合成黄原胶的过程中, 需要8 种膜结合酶4 : 5种特异转移酶, 1 种乙酰化酶, 1 种缩酮转移酶, 1 种聚合酶. 在酶的作用下两分子UDP2D2葡萄糖前体顺序添加到糖基载体脂上形成黄原胶主链上的一分子12磷酸2D 葡萄糖和一分子D2葡萄糖, 再由GDP2D2甘露糖和UDP2D2葡萄糖醛酸前体分别添加D2甘露糖和D2葡萄糖醛酸, 然后乙酰辅酶A 上的乙酰基转移到连接在两个葡萄糖基间的甘露糖基上, 磷酸烯酮式丙酮
9、酸的丙酮酸则添加到另外一个甘露糖上,这样就形成了黄原胶的五糖重复单位, Ielp i, Cou so等人证明了这个过程5 . 最后, 五糖重复单位在聚合酶的作用下聚合成黄原胶.微生物多糖的发酵技术出芽短梗霉( A ureobasi di um p ul l ul ans )产生短梗霉多糖,短梗霉多糖属于次级代谢产物,多糖的合成与细胞生长呈现部分相关，短梗霉多糖分批发酵过程中菌体生长、产物形成和底物消耗随时间的变化。黄原胶发酵菌种一般采用甘蓝黑腐黄单胞菌（Aanthomonas Campestris），培养基碳源可以是淀粉、蔗糖、葡萄糖等碳水化合物，氮源最好是由有机氮源与无机氮源所构成的复合氮源
10、，另外培养基中还有一些微量元素及促进剂，在发酵罐内适当条件下经过一定时间的发酵，得黄原胶发酵液，再经适当的后处理，即可得产品黄原胶。黄原胶后处理可以采用三种不同工艺，即酒精（或异丙醇）提取工艺、碱式沉淀工艺、超滤微滤工艺。 2微生物多糖的提取与纯化根据多糖种类、性质的不同, 可以采用不同的提取纯化方法.胞内和胞壁多糖的提取是先破碎细胞, 然后在802100下以水(或氢氧化钠、氢氧化钾水溶液) 为溶剂反复提取223 次. 将得到的多糖溶液进行离心除去不溶物质, 减压浓缩后合并上清溶液, 然后用乙醇或异丙醇沉淀多糖; 再次离心后用丙酮、乙醇等有机溶剂洗涤, 再冷冻干燥得到多糖粗制品. 胞外多糖的提
11、取稍微简单些, 只要离心发酵液除去菌体得到上清, 然后用有机溶剂沉淀多糖, 静置、离心、干燥就可以得到多糖粗制品了.粗多糖中常含有蛋白质等杂质, 常用Sevage法、三氟三氯乙烷法和三氯乙酸法、酶法去除, 这四种方法各有优缺点. Sevage 法是根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点, 将糖溶液和Sevage 液(V氯仿:V 正丁醇= 3: 125: 1) 混合后剧烈震荡10 m in 30 m in, 静止或离心后除去水层和溶剂交界处的变性蛋白. 此法除蛋白效率不高, 但多糖不易降解.三氟三氯乙烷法是将多糖溶液与三氟三氯乙烷等比混合后搅拌、离心, 如是重复几次即得到无蛋白糖溶液, 但三氟三
12、氯乙烷易挥发不宜大量使用. 三氯乙酸法是向多糖溶液中滴加三氯乙酸至不再继续出现混浊为止, 离心除去沉淀即得到无蛋白的多糖溶液, 但此法会引起多糖的降解. 酶法去除蛋白条件最温和,不易引起多糖的降解, 但不同的酶作用于不同的蛋白, 所以要先进行不同酶除蛋白能力的探索, 最后才能确定最佳的除蛋白酶法.此时, 得到的多糖可能是多种多糖的混合样品,还要采用分部沉淀法、季胺盐沉淀法、柱层析法、超滤法、制备性区域电泳等方法进一步分离纯化.5微生物多糖的应用研究5. 1食品工业现已获得工业生产与应用的微生物胞外多糖主要有黄原胶、结冷胶、小核菌葡聚糖、短梗多糖、热凝多糖等, 由于它们具有粘着性、稳定性、凝胶性
13、、乳化性等特点而广泛应用于品工业, 可以作为食品添加剂、凝结剂、保鲜剂等(见表2).结冷胶是美国Kelco 公司开发一种水溶性微生物胞外多糖, 并于1992 年被批准在食品中广泛使用, 成为第三种在品中用的微生物胞外多糖. 在食品中, 结冷胶不仅是一种凝结剂, 它还具有提供优良的地和口感,变食品组织结构、液体营养品的物理稳定性、食品烹调和贮藏时的持水能力等功能, 因而广应用于糖衣、色拉调料、人造肠衣、果冻、果酱、馅料等食品中.黄原胶的特性主要集中在流变学性质方面8 :它具有较强的增稠性, 良好的假塑性、稳定性; 耐酸碱、抗热、耐高盐环境;具有良好的乳化性质和悬浮能力. 因此, 黄原胶作为增稠剂
14、、稳定剂、乳化剂等在食品工业中也得到了广泛的使用.5. 2医药领域在医药领域得到广泛应用研究的微生物多糖主要是真菌多糖, 大多数真菌多糖具有抗肿瘤免疫调节、抗衰老、抗感染等生物学功能.复合多糖各组(主要由猴头菇、香菇、茯苓3 种真菌的多糖、葡萄籽多酚以及甘草酸成)对荷瘤小鼠的肿瘤都有明显的抑制作用, 并且复合多糖各组对S180 肉瘤小鼠腹腔巨噬细性明显增强. 海洋真菌多糖YCP 具有显著提高S180 荷瘤小鼠RES 吞噬功能; 明显提高肺癌荷瘤小鼠的N K 细胞活性, 促进N K 细胞杀伤靶细胞K562; 明显提高CTL 细胞活性, 促进CTL 细胞杀伤靶细胞L ew is肺癌细胞; 由此,
15、推测YCP 可能通过增强机体的细胞免疫功能,达到抑制肿瘤生长的作用.另外, 灵芝、云芝、猴头等真菌多糖具有降血糖作用; 虫草、灵芝、香菇、银耳、云芝、茯苓等真菌多糖可作为功能性食品的活性成分, 起保健作用. 还有多种食用菌多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的活性, 起到保护生物膜和延缓衰老的作用11 .5. 3环境保护(污水处理)随着经济的发展和生活节奏的加快, 自然界出现了越来越多的生活废水和工业废水, 废水中常含有严重影响人类健康的可溶性重金属(铬、镉、铅、锌、铜等). 虽然现已采用多种技术和絮凝剂(无机絮凝剂、人工合成的有机絮凝剂、生物絮凝剂) 来处理这类废水, 但这些
16、处理方法仍不尽如人意: 重金属去除不彻底; 产生有毒的污泥; 离子交换树脂和活性炭处理效果好但费用较高也不能大规模运用. 生物絮凝法(活性污泥法) 是当时广泛采用的处理废水的方法之一, 它主要利用微生物及其代谢产物来去除重金属, 它的最大优点是: 选择性高, 效率高, 准备和操作消耗低. 但利用活微生物体处理废水并不现实, 需要给这些微生物的生长繁殖提供一定的营养物质和生长条件; 利用死的微生物虽然可以解决上面的问题, 但处理废水后的微生物难以去除并且难以重建使用.目前, 用微生物代谢产物处理废水是一个极具应用前景的废水处理方式, 多糖是该代谢产物的主要成分12 , 因它所带的负电荷基团可以和二价阳离子结合而在生物絮凝和重金属处理中起着非常重要的作用13 . G. Gu ibaud 等人14 发现: 活性
