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1、发酵菌种的自然选育一、 实验目的1. 学习从自然环境中分离工业微生物菌株的方法。2. 熟悉无菌操作技术。二、 实验原理 土壤是微生物是微生物生长的大本营，水体是微生物生长的第二场所。自然界中微生物种类繁多，而且都是混在一起的，要获得发酵菌株，首先必须把它们从混杂的微生物群体中分离出来。 分离微生物菌株最基本的方法就是稀释法。将样品放于无菌水中，通过振荡，使微生物悬浮于液体中，然后静止一段时间，由于样品沉降较快，而微生物细胞体积小沉降慢，会较长时间悬浮在液体中。通过对微生物细胞悬浮液的进一步稀释和选择性培养，就可以分离出我们需要的目的菌株。基本特征：能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并能生成较
2、多的发酵产物。培养条件如温度、渗透压等易控制抗杂菌和抗噬菌体能力较强。遗传稳定性高、不易退化。不产生有害的生理活性物质或毒素（食品或医药微生物菌株）。本实验以土壤或淡水微生物的分离为例，介绍发酵菌株的自然选育方法，若要筛选海洋微生物，在配制培养基及无菌水时应用陈海水代替蒸馏水和生理盐水，其他操作都一样。三、 实验器材与试剂1. 样品土壤、水、苹果2. 培养基Zobell 2216E 琼脂培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g，FePO4 0.01g，NaCl 10g，琼脂20g，加水至1000mL，pH 7.27.4。营养琼脂培养基:蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂20g，加水至1000
3、mL，pH7.27.4。高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO47H2O 0.01g，琼脂 20g，加水至1000mL，pH 7.27.4。苹果培养基:马铃薯（去皮）200g，煮沸20 min后过滤，滤液中加蔗糖20 g和琼脂20 g，补水至1000mL，pH自然。若要筛选海洋微生物，上述培养基用陈海水（或2%海盐）配制。3. 器材高压蒸汽灭菌锅，恒温干热灭菌箱，超净工作台，天平，电炉，1 mol/L NaOH，刻度搪瓷杯，量筒、漏斗，玻棒，三角瓶，玻璃珠，试管，培养皿、移液管、防水纸等。四、 实验步
4、骤1. 培养基制备细菌分离用Zobell 2216E琼脂培养基或营养琼脂培养基。寡营养细菌（oligotrophic bacteria）的分离用稀释10倍的Zobell 2216E 琼脂培养基。放线菌分离用高氏一号培养基。真菌分离用苹果培养基。通过称量、溶解、调节pH等步骤，配制上述培养基，并配制45mL无菌水（内装几颗玻璃珠）1瓶，4.5mL无菌水若干支，0.1MPa灭菌30min后备用；另包扎好培养基、移液管和涂布棒等，灭菌，烘干备用。2. 倒平板将灭菌后的培养基冷却至5060，以无菌操作法倒至经灭菌并烘干的培养皿中，每皿约20mL。为了防止非目的的菌株的生长，可在真菌培养基中加入链霉素使
5、之达到30mg/L，以抑制细菌的生长，在细菌和放线菌培养基中加入制霉菌素使之达到100mg/L，以抑制真菌生长。冷却凝固待用。3. 微生物分离（涂布法）称取样品5g（液体样品5mL），放入装有45mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为10-1的土壤稀释液。取4.5mL无菌水4支，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5。取10-1的稀释液，振荡静止2min后，用无菌移液管吸取0.5mL上层细胞悬液加至装有4.5mL无菌水的试管中，制成10-2稀释液。同法依次稀释至10-3、10-4、10-5稀释液。在稀释过程中，因从高浓度到低浓度，每稀释一次应更换一只移液管。另取移液管，分别以无
6、菌操作法吸取10-5、10-4、10-3的稀释液0.1mL（依样品中微生物的多少选取不同的稀释度），加至制备好的平板上，用无菌刮刀（涂布棒）涂布均匀。从低浓度到高浓度，可以用同一根移液管或者涂布棒（见图1-1）。将培养基倒置培养于恒温培养箱中，细菌37培养12d，真菌30培养35d，放线菌30培养57d后观察。若杂菌干扰不严重，可适当延长平板的培养时间，以便挑取生长速度较慢的菌株。根据菌落形态特征，挑取有代表性的单菌落（尽量挑取不同类型的菌落），在相应培养基的平板上划线，直至得到纯培养（通过显微镜检查确认只有单一形态的菌株）。纯化后的菌株应及时转接到斜面培养基上保存。对分离获得的纯培养进行特定
7、能力的测定（详见实验1-3）。五、 注意事项1. 培养箱中最好放置一杯水以增加湿度，分离放线菌的平板应相对厚一些，避免因培养时间过长而干掉。2. 样品的贮藏时间不宜过长，因为样品是破坏了自然体，水、热、气等因子与原来环境中的不一样，如果贮藏时间稍长，一些“娇气”的微生物容易死亡，所以要想从土壤中找出有价值的微生物，应当克服这种藏与死的矛盾。3. 筛选海洋微生物，应用陈海水（或2%海盐）代替蒸馏水和生理盐水，其他操作都一样。Zobell 2216E 琼脂培养基对筛选海洋细菌比较适宜。4. 样品的采集要有针对性。分离淀粉酶产生菌最好在栽培淀粉谷物的土壤中采集，分离蛋白酶产生菌最好在蛋白加工厂周围（动物蛋白）或栽培豆科植物的土壤中（植物蛋白）里采集。
