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1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减紫杉醇脂质体对子宫内膜癌Ishikawa细胞的体外杀伤作用（作者：单位：邮编：）作者：朱丽红，魏丽惠，李小平，赵丽君 刘宁【摘要】目的 探讨注射用紫杉醇脂质体对人子宫内膜癌细胞系的体 外杀伤作用。方法 以不同浓度含紫杉醇脂质体的培养基作用于人子 宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞，并设对照（普通培养基），通过MTT 倒置显微镜观察细胞增殖状况及形态，流式细胞分析技术检测该药对 细胞生长的影响。结果 经不同浓度紫杉醇脂质体作用2496h，细胞存活率显著下降（P0.05）;镜下观察显示部分细胞皱缩变形，崩解 坏死，细胞脱壁悬浮；流式细胞术结果显示细胞凋亡率逐渐增
2、加，细 胞周期各时相中，S期比例减少。结论 紫杉醇脂质体可抑制子宫内 膜癌Ishikawa细胞的生长。【关键词】 紫杉醇；脂质体；子宫内膜癌；Ishikawa细胞系；杀伤 作用Ishikawa cells in vitro.ABSTRACT: Objective To investigate the killing effect ofliposome encapsulated paclitaxel on endometrial careinomaMethods The human endometrialcareinoma Ishikawa cell line was cultured with
3、 different concen trati ons of the liquid form of liposome en capsulated paclitaxel. MTT assay, inv erted microscopic observati on and flow cytometry assay (FCM) were then used to monitor the growth and proliferati on of the cell li ne. Results Whe n treated with differe nt concen trati ons of lipos
4、ome en capsulated paclitaxel for 24 to 96 hours, Ishikawa cells survival rate decreased significantly (P0.05); degeneration and necrosis of Ishikawa cells were found un der microscope. The rate of cell apoptosis was in creased and the rate of S phase was reduced. Con clusi on Liposome encapsulated p
5、aclitaxel can inhibitendometrialcarc inoma cells.KEY WORDS:paclitaxel; liposome; endometrial carcinoma; Ishikawa cell li ne; killi ng effect紫杉醇(paclitaxel)是一种存在于紫杉烷类植物树皮和枝叶中的二萜烯类物质，能够稳定细胞微管阻止细胞分裂而抑制癌细胞生长。临床研究表明，紫杉醇对多种实体肿瘤疗效显著。但其水溶性差，聚氧 乙基代蓖麻油和无水乙醇组成的混合溶媒会引起组胺的释放，易导致严重的过敏反应1。脂质体作为一种新型的药物载体，具有靶向性 和缓释性
6、，可提高疗效，降低毒性2，是目前研究的热点。本研究 探讨紫杉醇脂质体对子宫内膜癌Ishikawa细胞系的体外杀伤作用， 为临床应用提供实验依据。1材料与方法1.1癌细胞株Ishikawa细胞株系北京大学人民医院妇产科实验室 保存并传代培养。1.2药物与试剂 注射用紫杉醇脂质体（商品名：力扑素，南京思科 药业有限公司），30mg併瓶，国药准字 H20030357用10mL 50g/L葡 萄糖注射液稀释，专用震荡器振摇 5min后使用。DMEM高糖细胞培养 基为Hyclone生物化学制品，产品标准号：Q/SY HKL001胎牛血清 （PAA细胞公司）。胰蛋白酶、二甲基噻唑二苯基四唑溴盐（MTT,S
7、igma）。Ann ex in V拟FITC凋亡检测试剂盒（北京大学人类疾病基因 研究中心）。1.3细胞培养 选用雌激素受体阳性的人子宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞，于含100mL/L胎牛血清的DMElW糖培养基中，在恒 温培养箱（Heraeus）中以50mL/L CO2、37C及饱和湿度条件下传代 培养。设对照组（普通培养基）、紫杉醇脂质体0.01卩mol/L组、0.1 a mol/L 组、1 卩 mol/L 组、10 卩 mol/L 组和 100 卩 mol/L 组。1.4 MTT检测 取进入对数生长期的细胞，以3X 105/L接种于96孔 培养板中，每组设8个平行孔。细胞铺板培养24
8、h贴壁后，每孔加入 150 a L相应浓度的含药培养基，24、48、72、96h后，每孔加入5mg/mL 的MTT容液20 a L，继续培养4h，吸弃孔内培养基，每孔加入100 a L盐酸异丙醇（浓盐酸与异丙醇的体积比为1 : 250），震荡摇匀10min， 室温静置20min后，在酶联免疫检测仪（Bil拟Rad Model 550）上选择 570nm波长测定各孔吸光度（A）值，并计算细胞存活率，即：细胞存 活率二实验组平均A值/对照组平均A值X 100%重复上述实验3次， 取其均值。1.5倒置显微镜下观察细胞形态 应用1X71拟.141型倒置显微镜（日 本OLYMPU公司）分别观察对照组及紫
9、杉醇脂质体各组作用 Ishikawa 细胞24、48h的细胞形态。1.6流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化各组培养48h,分别以2.5g/L胰酶消化收集细胞106个，冷PBS中洗2次，收集并离 心弃上清，细胞各分两管分别检测细胞凋亡和细胞周期。检测细胞凋亡管分别加入200卩L Bin di ng Buffer 和FITC标记的Ann exi n V（20 卩g/mL）10 L/管，避光反应30min，再加PI（50卩g/mL）4卩L，避光 反应5min，补齐Binding Buffer 至500 L，立即（一般不超过1h） 进行流式细胞术检测细胞凋亡。检测细胞周期管分别加入800mL/L冷
10、 乙醇固定，4C过夜，冷PBS中洗，离心弃上清，加300卩L PBS10mg/mL 的Rn ase A溶液15卩L混匀，37C孵育30mi n，力口 1mg/mL的 PI染液 混匀，暗室中放置 30min后，转入流式管以 FACSort流式细胞仪 （FACSCalibur，美国BD公司）进行荧光检测，ModFit LT软件分析细 胞周期各时相的特点。重复上述实验 2次，取其均值。1.8统计学处理 使用SPSS13.0统计软件包处理，数据用士 s表示， 进行重复测量的方差分析，P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1紫杉醇脂质体对子宫内膜癌Ishikawa细胞的生长抑制作用MTT法检测结果显
11、示：不同浓度的紫杉醇脂质体作用Ishikawa细胞 2496h,相同药物浓度下，随着作用时间的延长，细胞存活率逐渐 降低（P0.05，图1）;相同作用时间下，随着药物浓度的升高，细胞 存活率逐渐降低（P0.05，图2）。提示紫杉醇脂质体对子宫内膜癌 Ishikawa细胞有抑制和杀伤作用，并呈浓度和时间依赖性。2.2倒置显微镜下观察紫杉醇脂质体作用24、48h Ishikawa细胞形态学变化对照组的Ishikawa细胞胞质透亮，细胞形态规则，呈 细长多边形，贴壁良好，排列紧密，呈对数生长。不同浓度紫杉醇脂 质体作用后，随着药物浓度的增加和作用时间的延长，细胞固缩，胞 质减少，形态轮廓不清晰，部分
12、细胞核膜消失，细胞皱缩变圆，崩解 坏死，碎片增加，细胞核碎裂，细胞脱壁至悬浮状态。紫杉醇脂质体 作用Ishikawa细胞48h，可见到凋亡细胞，随着药物浓度的增加， 从1卩mol/L浓度起，白色的脂质体沉积逐渐明显（图3）。2.3流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化紫杉醇脂质体作用Ishikawa细胞48h，细胞凋亡情况及细胞周期变化见图 4和图5。 结果显示细胞凋亡率显著增加（P0.05） ; S期细胞所占比例减少。提 示紫杉醇脂质体可抑制Ishikawa细胞增殖（表1）。3讨论紫杉醇是一种具有独特结构和独特作用机制的高效、广谱、天然抗 肿瘤药，对乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤疗效显著。但其溶解
13、度差，临 床使用前的常规预处理也无法杜绝溶媒引起的过敏反应。注射用紫杉醇脂质体以磷脂、胆固醇等为膜材料，采用特殊工艺将紫杉醇包被在 脂质体中，不再使用混合溶媒，避免了溶媒引起的毒副反应。子宫内膜癌是妇科三大恶性肿瘤之一， 可分为两种亚型3 , I型为 雌激素受体阳性，组织类型多为子宫内膜样癌，分化较好。H型与高 雌激素无关，肿瘤分化差，通常为非子宫内膜样癌。子宫内膜癌的治 疗包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗等。文献报道紫杉醇可用于晚 期内膜癌患者4，但关于紫杉醇脂质体的应用目前尚无报道。本实 验以雌激素受体阳性的子宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞为研究对象，MTT法检测证实在紫杉醇脂质体的作
14、用下，子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖能力明显受到抑制，且存在时效和量效关系。倒置显微镜 观察发现，随着药物浓度的增加和作用时间的延长， 肿瘤细胞变形皱 缩、崩解坏死、脱壁悬浮，并有细胞凋亡产生，表明该药对肿瘤细胞 生长有抑制作用。流式细胞术检测显示，与对照组相比，用药后的各 组细胞凋亡率显著增加，S期细胞所占比例减少，说明在实验药物作 用下，肿瘤细胞的DNA合成复制受到抑制，细胞增殖分裂减慢。目前已知，紫杉醇类药物能够促进微管蛋白装配成微管，抑制微管 的解聚，使纺锤体失去正常功能，抑制细胞有丝分裂，导致细胞死亡， 从而抑制肿瘤细胞增殖6。研究还发现，紫杉醇抗肿瘤作用的机制 除了与抗微管作
15、用有关外，还与诱发细胞凋亡有关6。本实验对Ishikawa细胞的形态学观察和流式细胞术的检测结果亦证实了这一 点，并与文献报道结果一致。因此，本实验从细胞生物学水平证实了紫杉醇脂质体对子宫内膜癌 Ishikawa细胞系的体外杀伤作用，但其影响细胞信号转导等机制有 待进一步深入研究。【参考文献】1 吴洪斌.紫杉醇注射液不良反应的预防及处理J. 中国新药杂志，2002, 11(2):168拟 169.2 黄义昆.脂质体作为药物载体的研究进展J. 中国药师,2005, 8(7):549 拟550.3 RISINGER JI, MAXWELL GL, BERCHUNK A, et al. Promot
16、er hypermethylation as an epigenetic component in Type I and Type II endometrial cancers J. Ann N Y Acad Sci, 2003, 983:208 拟 212.4 DUSKA LR, BERKOWITZ, MATULONIS, et al. A pilot trial of TAC(paclitaxe, doxorubicin, and carboplatin) chemotherapy with filgastrim support followed by radiotherapy in patie ntswith high 扌以
