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1、【一、提RNA】一、实验准备:1、试剂:75%乙醇、Trizol、1.5mL 进口EP管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RNA专用)、2、配75%乙醇(DEPC水+无水乙醇),放-20冰箱预冷;3、预冷离心机(1.5mL EP管用的);4、清洁桌面,酒精喷过之后擦干,新手套、两层口罩;二、操作步骤:01、弃上清(不回收,直接倒去);02、1mL/孔 PBS洗两遍(不回收,直接倒去,随后用200L枪吸尽PBS);03、每孔加500L Trizol,轻晃,随后室温放置2min左右;04、枪头吹打,吸出放入1.5mL 进口EP管;05、加入100L氯仿(即1/5体积的trizol);06、4离心机,120
2、00g,15min;07、吸200L(可减少)上清放入新的1.5mL 进口EP管中(注意:只能吸到上清);08、加入等体积异丙醇,充分混匀,常温放置10-30min(15min);09、4离心机,12000g,10min;10、倒掉液体,加入1mL预冷的75%乙醇剧烈混匀;11、4离心机,7500g,5min;12、倒掉上清,加入1mL预冷的75%乙醇,混匀;13、4离心机,7500g,5min;14、倒掉上清,倒扣在餐巾纸上,5-10min,用针头或者200微升枪头去掉管壁上的水珠;15、每管中加入40L(40-60L)的DEPC水,吹打溶解;16、测浓度(先知楼21楼测RNA浓度,带DEP
3、C水、灭菌的dd水、10微升枪和枪头);三、注意事项01、如果当时不测RNA浓度,可暂时把RNA放在-20冰箱。但长时间(24h)保存,需要放在-80冰箱;02、异丙醇作用是沉淀RNA,作用比乙醇好;03、04、05、06、07、08、09、【二、测RNA浓度】一、实验准备:01、先知楼21楼-2109教室,一个冰盒+DEPC水+10微升枪、灭菌dd H2O、10L枪头(RNA专用)、本子+笔;二、操作步骤:01、登记;02、打开电脑=打开“N”软件=点击“Nucleic acid”=选择“OK”=选择“RNA”;03、灭菌dd H2O清洗2-3遍,擦干;04、DEPC水 校零:即加DEPC水
4、一滴,点击“Blank”,擦干;05、测RNA:加样品一滴,点击“measure”,擦干,随后加下一个样品;06、记录数据,包括RNA浓度(0.1。(请注意,这个值跟仪器无关,核酸的吸光度必需大于 0.1,其值才有效和可靠,因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收,其值0.1);2.A280nm、A270nm是蛋白最高吸收峰的吸收波长,比值可进行核酸样品纯度评估:纯 DNA 的 A260/A280比值为1.8,纯RNA为2.0。如果比值低,表示受到蛋白(芳香族)或酚类物质的污染,需要纯化样品。比值=1.5 相当于50蛋白质/DNA溶液.酚的最大吸收峰在270nm。3. A23
5、0nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长,比值可进行核酸样品纯度评估:纯DNA 和 RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0 标明样品被碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染,需要纯化样品。A230产生负值主要是由于在很低 DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中,需要降低样品的稀释度,A230的负值会被校正。4. A320nm或A340nm 为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。该值应该接近0.0。如果不是,标明溶液中有悬浮物,需要纯化样品。纯样品的A320一般是0。5. A260/A280和A260/A230 是核酸纯度的指示值。纯度好的DNA或RNA,
6、在pH7-8.5 下A260 / A280的比值应该在2.0 或2.5。纯净的样品比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物、盐(胍盐)等,较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。当0.5BSA蛋白质污染时,蛋白污染会导致260和280的数值都下降,其净结果是260/280比值下降,但260/280的比值变化并不显著,正如分子克隆3所说。但蛋白残留会导致230的数值显著上升,显著影响260/230的比值。也就是说,如果RNA样品的260/2801.7,260 /2300.
7、5,那么就应该考虑污染原因不是胍盐残留,而是蛋白残留.用分光光度计测量RNA时,用水而不是用TE 缓冲液稀释RNA样品会造成A260/A280比值下降。原因是低离子强度和低pH溶液会增加280 nm处的光吸收值。加氯仿离心后取上清的时候千万不要贪多,那样就很容易被蛋白污染,所以现在一般取400ul左右。6.当260/230加1号试剂(2L)=加3号试剂(0.5L)=加4号试剂(0.5L)=加2号试剂(0.5L)=加RNA=离心=上机;02、上机:OPEN=点击“User”菜单下的“clx”,点击“Accept”=选择“run”下面的到“exp001 rt”=修改体系“10L”(默认为25微升)
8、=点击“Start”,进入界面;03、37.0 15min=85.0 5s=4.0 60min;04、4冰箱保存;三、注意事项01、加液尽量无气泡,枪不要打到底;02、严格冰上操作,防止RNA降解;【qRT-PCR】一、实验准备:01、试剂:Roche的SyBr Green(rox)02、1.5mL EP管、0.2mL EP管、96孔板/八连冠;10L、20L、100L、200L、2.5L、1000L枪;03、冰盒一个、Rox化冻(避光)、引物化冻(GAPDH)、cDNA、DEPC水;二、操作步骤:01、 Rox 10L;+ dd H2O 6L;+ P1(F) 1 + P2(R) 1 + cD
9、NA 2-20L体系02、计算:每个样,X个抗体(至少包括GAPDH-内参,还有目的),三个副孔。 即如果六个样,2个抗体(GAPDH,PLK1),三个副孔。6*1*3=1820(PLK1),6*1*3=1820(GAPDH);1234567891011126/PLK16/PLK16/PLK15/PLK15/PLK15/PLK16/GAP6/GAP6/GAP5/GAP5/GAP5/GAP4/PLK14/PLK14/PLK13/PLK13/PLK13/PLK12/PLK12/PLK12/PLK11/PLK11/PLK11/PLK14/GAP4/GAP4/GAP3/GAP3/GAP3/GAP2/G
10、AP2/GAP2/GAP1/GAP1/GAP1/GAP PLK1 Rox:10*20=200L DEPC水:6*20=120L F:1*20=20L R:1*20=20L GAPDH Rox:10*20=200L DEPC水:6*20=120L F:1*20=20L R:1*20=20L03、稀释cDNA 10倍(18L DEPC水+2L)=配置Mix(Rox+ DEPC水+F+R)=加样(一横排先加18L mix(GAPDH),随后加入18L mix(PLK1)。 随后六个孔加同一个cDNA;06、去除气泡:加好样后,观察有无气泡。如果有气泡,弹开,随后2000rpm离心,时间不定(5s即可
11、);07、上机+设置程序: A、双击打开程序“ StepOne Software v2.1 ”=点击“ OK ”=点击“Ignore & Continue Startup ”=点击“ Advanced Setup ”=进入“ Experment Properties界面 ”;B、Experment Properties界面: 将Expriment Name从Untitled 修改为“日期,如2015-12-17”,将User Name(Optional)修改为“CZL”; Which instrument are you using to run the experiment ?中选择“96
12、wells”,一般无需修改; What type of experiment do you want to setup ?中选择“Quantitation-Comparative CT(CT)”; Which reagents do you want to use to detect the target sequence ? 中选择“SYBR Green Reagents”; Which ramp speed do you want to use in the instrument run ? 中选择“Fast( 40 minutes to complete a run)”;C、Plate Setup界面-Define Targets and Samples界面: Define Targets栏中:如果有GAPDH、PLK1、Akt、PI3K三个引物,则点击“ Add New Target ”三下,出现“Target