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1、 聚肌胞对人早孕绒毛外滋养细胞TLR3表达的调节作用 作者：王菊1,钟刚2 作者单位：1 518106 广东深圳，深圳市光明新区公明人民医院妇科 2 广东深圳，华中科技大学同济医学院附属同济医院 【摘要】目的 通过体外实验研究Toll样受体3(TLR3)在人早孕绒毛外滋养细胞株TEV-1的表达及聚肌胞PolyI:C对TLR3 mRNA和蛋白的调节作用。方法 体外培养TEV-1细胞;用不同时间及浓度聚肌胞刺激TEV-1细胞后RT-PCR和流式细胞仪检测其TLR3 mRNA和蛋白的表达变化;免疫细胞化学SP染色法检测TLR3蛋白的定位表达。结果 (1)PolyI:C 刺激可上调TEV-1细胞株TL
2、R3 mRNA的表达(P 0.01)，且与刺激时间和剂量呈正相关。(2) PolyI:C 刺激可上调TEV-1细胞株TLR3蛋白表达的平均荧光强度(P 0.01);但荧光阳性细胞数刺激12h与刺激前比较差异无显著性(P 0.05);刺激24h、48h的荧光阳性细胞数与刺激时间和剂量呈正关(24h P 0.05;48h P 0.01)。(3)免疫细胞化学显示TLR3主要定位于TEV-1细胞株的细胞浆。结论 TEV-1细胞株TLR3的mRNA及蛋白的表达与Poly(I:C) 刺激时间及剂量呈正相关;TLR3主要定位于TEV-1细胞株的细胞浆，而细胞核及细胞膜没有观测到明显表达。提示人早孕绒毛外滋养
3、细胞可能通过细胞浆的TLR3参与早孕母-胎界面的免疫反应。 【关键词】 TLR3;Poly(I:C);TEV-1细胞株;流式细胞仪;平均荧光强度;荧光阳性细胞数;免疫细胞化学 Abstract Objective To investigate the regulatory effect of PolyI:C on the expression of TLR3 mRNA and protein in the human extravillous trophoblast cell line (TEV-1)，and whether the regulatory effect depends on P
4、olyI:C s dose and time.Methods Semi-quantitative RT-PCR analysis，flow cytometry and immuo-cytochemistry were used to dedect TLR3 mRNA and protein expression level and location in TEV-I cell line.Results (1)The expression of TLR3 mRNA in TEV-I cell line significantly increased with the PolyI:C s stim
5、ulation time and dose increase; compare to without PolyI:C s stimulation(P 0.01).The mean fluorescence intensity of the TLR3 protein in TEV-I cell line increased with the PolyI:C s stimulation time and dose increase; compare to without PolyI:C s stimulation(P 0.01).(2)The number of fluorescence posi
6、tive cell of the TLR3 protein stimulated 12 hour had no statistics significance(P 0.05); But its increased with the stimulation time and dose increase in 24 and 48 hour intervention(24h P 0.05 ; 48h P 0.01).(3)The Immuocytochemistry result revealed that TLR3 protein was expressed in TEV-I cell line
7、s cytoplasma.However，it s hardly to see the expression in the cellular membrane and nucleus.Conclusion TLR3 protein was expressed in TEV-I cell line and localized to the cytoplasma.The increase of mRNA and protein expression of TLR3 in TEV-I cell line depends on the increase of the dose and time for
8、 PolyI:C s stimulation. Key words TLR3，PolyI:C;TEV-I cell line; flow cytometry; average fluorescence intensity; the number of fluorescence positive cell 正常妊娠时母-胎界面存在着很强的免疫反应，其主要作用是促进胚胎植入和调节胎盘的发育，使母体对半异体来源的胎儿、胎盘产生耐受;同时，维持宿主防御反应，从而阻止病原微生物对机体组织和妊娠的破坏。母胎界面处的滋养细胞、免疫活性细胞及细胞因子，构成了母-胎界面的免疫微环境，对于妊娠的建立、维持、胎儿的
9、生长发育以及分娩发动起着重要作用1。而妊娠病理(如:反复自发性流产、早产、子痫、胎膜早破、IUGR等)则与母-胎界面的免疫微环境的改变有关2。因此，母-胎界面处细胞生物学和分子免疫学的研究已成为医学研究的热点之一。 天然免疫性细胞是可以通过对病原体表达的病原体相关分子模式识别各种病原体的。Toll样受体是近年来发现的重要的免疫受体，它在天然免疫中通过对病原体相关的分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的识别发挥作用，通过刺激信号的级联反应导致细胞因子的产生和协同刺激因子的表达，从而在天然免疫和获得性免疫中起到了桥梁的作用3。近年来的研
10、究进展还发现Toll样受体也广泛表达于女性生殖系统及母-胎界面，在局部抗感染、生殖免疫、妊娠免疫的生理及病理过程中发挥着重要作用4，5。本研究采用RT-PCR、流式细胞仪检测及免疫细胞化学SP法染色法测定Toll样受体3(TLR3)蛋白在人早孕绒毛膜外滋养细胞株(TEV-1)的定位及基因、蛋白表达和聚肌胞对其表达的影响，从而探讨TLR3在母-胎界面的表达及免疫作用。 1 材料与方法 1.1 细胞株来源 人早孕绒毛外滋养细胞株TEV-1由香港大学馈赠。 1.2 试剂 单克隆小鼠抗人TLR3一抗：美国Santa Cruz 生物技术公司;羊抗小鼠IgG荧光二抗(FITC标记)：购自美国KPL生物技术
11、公司;引物：由上海博亚公司合成;Poly(I:C)：美国Sigma生物技术公司。 1.3 方法 1.3.1 细胞培养 TEV-1细胞株接种于细胞培养瓶，用DMEM/F12培养液及10%胎牛血清的混合液45ml在培养箱中培养。待80%融合后，吸掉旧培养基，D-Hanks液洗涤细胞1次，0.25%胰蛋白酶消化12min，在倒置显微镜下观察，当细胞将分离而呈圆粒状时，立即加入适量含血清的新鲜培养基终止胰蛋白酶的作用。再用吸管反复吹打细胞培养瓶壁使细胞脱落，并把细胞吹散至均匀。然后依1：3的比例转移至新的培养瓶中，以上述条件培养。 1.3.2 流式细胞仪检测TLR3蛋白在TEV-1细胞株的表达 将TE
12、V-1细胞株种植于7个培养皿中培养，生长至80%融合后换成1ml的optin -MEM培养液培养。6个培养皿中分别加入poly(I:C)12 g、25 g及分别培养12、24、48h，另一培养皿则不加。然后制成细胞悬液，无水乙醇固定，加入50 l 0.2% TritonX100破膜，PBS洗2次。加BSA稀释的单克隆小鼠抗人TLR3一抗100 l，4过夜，PBS洗2次。加BSA稀释的羊抗小鼠IgG荧光二抗(FITC标记)100 l，4孵育30min，PBS洗2次,标本置流式细胞仪上检测。 1.3.3 RT-PCR 1.3.3.1 RNA的提取 参照TRIZOL试剂盒(美国GIBCOBRL公司)
13、说明书进行提取RNA。 1.3.3.2 逆转录cDNA合成 将RNA稀释为1 g/ l，取2 l RNA加入1 l Oligo (dT)15 (0.5 g/ l)、DEPC-H2O 7 l，充分混匀后，离心，在70孵育5min，迅速置于冰上，3min后离心;加入5 Reaction Buffer 4 l，dNTP Mix(10mmol/L)1 l，M-MLV Reverse Transcriptase(Promega公司，200U/ l)1 l，DEPC-H2O 4 42孵育60min;95孵育10min灭活逆转录酶活性，然后置4以备作PCR用。 1.3.3.3 引物设计 见表1。表1 -ac
14、tin和TLR3引物序列 1.3.3.4 聚合酶链式反应(PCR) 扩增体系：10 Taq Buffer 5 l，MgCl2(25mmol/L) 3 l，dNTP Mix(10mmol/L)1 l，引物各(10 mol/L)1 l，cDNA 2 l，Taq 聚合酶(1U/ l)1 l，DEPC-H2O 36 95预变性5min，94变性45s，54.4退火45s，72延伸1min，30个循环，72终末延伸10min。 1.3.3.5 琼脂糖凝胶电泳 75V电压下2%琼脂糖凝胶电泳40min，紫外灯下观察条带。 1.3.3.6 采用英国UVP公司GDS-8000型全自动凝胶成像分析仪扫描DNA条
15、带灰度值，用软件分析条带灰度比值。 1.3.4 免疫细胞化学SP法染色 将盖玻片置于细胞培养皿，将TEV-1细胞株接种于其中，放入细胞培养箱培养进行细胞爬片;取出细胞爬片冰丙酮固定20min，细胞面向上固定于载玻片上;3%H2O2 封闭内源性酶;5%的正常山羊血清封闭;以 1：100浓度稀释的单克隆鼠抗人TLR3一抗湿盒内4孵育过夜;苏木素复染后脱水、透明、中性树胶封片。HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统拍照。 1.3.5 统计学处理 所有数据均以均数 标准差(x s) 表示,用SPSS 11.5统计软件进行数据分析,组间比较采用LSD 检验。 2 结果 2.1 TLR3 mRN
16、A的表达及变化 TLR3 mRNA的表达随刺激时间及剂量的梯度的上升而增加，与刺激前比较，P 0.01(见图1、表2)。1泳道为刺激前结果;2泳道为12 g、12h结果;3泳道为25 g、12h结果;4泳道为12 g、24h结果;5泳道为25 g、24h结果;6泳道为12 g、48h结果; 7泳道为25 g、48h结果;M为Marker;530bp为 -actin扩增片段;334bp为TLR3扩增片段图1 TLR3的RT-PCR扩增产物检测结果表2 不同剂量及时间梯度Poly(I:C)刺激TLR3 mRNA在TEV-1细胞株的表达 2.2 TLR3蛋白的表达及变化 流式细胞仪检测TLR3蛋白的表达，平均荧光强度随刺激时间及剂量的增加而上升，与刺激前比较P 0.01(见表3); 而荧光阳性细胞数刺激12h与刺激前比较差异无显著性(P 0.05);刺激24h、48h随刺激时间及剂
