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1、-叶绿体的提取一、试剂配置1、PBS提取液:每L水依次加入MES(195.20.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33182.2=60.126g)、NaCl(0.01058.5=0.585g)、MgCl(0.00295=0.19g)、EDTA(292.250.002=0.5845g)、KH2PO4(2000.0005=0.1g);使用时加入ASA-Na(198.10.002=0.3962g);2、悬浮液:将PBS提取液中的MES换为238.30.05=11.915g的HEPES(238.30.05=11.915g);3、80%Percol:80ml原液+20ml水;40%Percol:40ml
2、原液+60ml水;实际配制:PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml), 悬浮液100ml(3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml); 80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.(3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml)二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS(50mM MES PH6.1,含0.33M山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA,0.5 mMKH2PO4,2mM ASA-Na,ASA-Na使用前现配现加)2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,4层纱布过滤
3、,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎)3、滤液2000g3min,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2-3min左右完成;4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物;5、用1ml悬浮液(50mM HEPES pH 7.6,含0.33 mM山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA,0.5 mMKH2PO4,2mM ASA-Na,ASA-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来
4、,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素2mg.ml-1以上,这样有利于保持活性。6、2000g 1min;7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做)8、用Percol试剂进行梯度离心(将3ml含有80%Percol(原液按100%算)铺在10ml离心管下层,再把3ml 40%Percol铺在离心管中层,然后将1ml叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)1500g 2-3min(用水平离心头的离心机,离心机加速要缓慢上升,加速度调到1),下降也要缓慢下降,否则会破碎Percol的浓度梯度层的形成,取出会看到3层绿色带,最上层为破碎的叶绿体,沉在地层的为粗颗粒,40-80%的
5、Percol之间的界面有一层绿色层为完整的叶绿体;9、小心吸出,转移到悬浮介质中,使叶绿体浓度达到1mg.ml-1;(计算:取叶绿体悬浮液0.1ml,加4.9 ml 80%的丙酮,摇匀后于1000g离心2min,上清液置于1cm的比色杯,在625nm上比色,按照公式计算:OD625nm50/34.5=叶绿素mg/ml)10、测定叶绿体的完整性,完整率达到85-95%;参考:Takeda K, Otaubo T,Konda N. Participation of hydrogen pero*ide in the inactivation of Calvin-cycle SH enzyme in
6、so2-furmugated spinach leaves. Plant and cell Physiology,1982,23:1009-1018.取上述制备的完整叶绿体进行如下测定:1、 用50mM PBS(保护酶或其他测定项目的缓冲液)稀释2-5倍,用于测定SOD、POD、CAT、AP*;2、 用冷丙酮稀释2倍,取0.5ML提取液用于测定H2O2;(本试验中用0.2 mol/L HClO4稀释)3、 用5%的TCA稀释2-5倍,取1.5ml用于测定MDA;4、 用乙醇:丙酮:水=4.5:4.5:1稀释,用于测定叶绿素;抗氧化酶(SOD、POD、CAT、AP*)活性测定方法一、 超氧化物歧
7、化酶(SOD)活性测定(氮蓝四唑光化还原法)1、试剂的配制(1)0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS,pH7.8):A母液:0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO412H2O(分子量358.14)71.7g;B母液:0.2mol/L磷酸二氢钠溶液:取NaH2PO42H2O(分子量156.01)31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/L PBS(pH7.8)的配制:分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml,B母液(NaH2PO4) 21.25ml,用蒸馏水定容至1000ml。参考文献:李合生主编:植物生理生化实验原理和技术.高等教育,2000:267268。
8、(2)14.5mM甲硫氨酸溶液:取2.1637g Met用磷酸缓冲液(pH7.8)定容至1000ml。(3)30M EDTA-Na2溶液:取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。(4)60M核黄素溶液:取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存。(5)2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液:取0.1840g NBT用PBS定容至100ml,避光保存。(上述试剂先配好,放到4度冰箱,用之前临时按下面的方法配,然后放在4度冰箱中,不要在最上层,避免见光,第一组样品加好后拿出来加,加完后放回冰箱,第二组的样品加好后再拿出来加)酶液制备:取0.2g(可视情况调整)样
9、品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中,加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上研磨成匀浆,转入离心管中在4、12000g下离心20min,上清液即为酶液。2、酶活性测定(1)反应混合液配制(以60个样为准):分别取Met溶液162ml,EDTA-Na2溶液0.6ml(加的量和前面的浓度要核对),磷酸缓冲液5.4ml,NBT溶液6ml,核黄素溶液6ml,混合后摇匀;SOD反应混合液:3个处理*2个品种*3次重复*3ml*3次测定=162ml(实际配置200ml)(2)分别取3ml反应混合液和30l(可视情况调整,最好先做一个浓度梯度,看加多少合适,如果量太少,
10、最好稀释后再加,这样精确)酶液于试管中(尽可能加到试管的底部,要靠着试管壁打下去先加酶液,后加反应液,加好后摇一摇,看看试管上是不是有雾气,最好拿纱布把试管下边擦一下,免得雾气挡住光线照过去);(3)将试管置于光照培养箱中在4000 lu*光照下反应20min;(照光很重要,试管要选择相同规格的,因为不同的试管透光率是不一样的,试管架不要选择遮光的,这个最好分组做,同时几组做相互之间会遮光,每一组一个重复,就是每一组中都要有所有的处理,且都要有一个最大管,处理多的话,把根和叶分开做,最大管放在中间)同时做两支对照管,其中1支试管取3ml反应混合液加入30l PBS(不加酶液)照光后测定作为最大
11、光还原管,另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。(4)以不照光的对照管(只有缓冲液并置于暗处)调零后,避光测OD560(出现颜色即可测定)。(5)酶活性计算:SOD活性单位以抑制NBT光化还原50所需酶量(测的样品值要在最大管的一半左右才合适,否则要调整酶量)为1个酶活单位(u)。SOD总活性 ( Ack-AE )V/(1/2AckWVt)SOD比活力SOD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示(u/g FW);比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示;Ack为照光对照管的吸光度;AE为样品管的吸光度;V为样品液总体积(ml,1.6ml,加入PBS的体积);Vt为测定时的酶液用量(ml,
12、30ul);W为样品鲜重(g,测定时应换算为叶绿体的质量mg);蛋白质含量单位为mg/g。二、POD、CAT酶活性的测定粗酶液制备同SOD。1、 过氧化物酶(POD)活性测定(愈创木酚法)(1)试剂配制:0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0):分别取A母液(Na2HPO4 ) 123ml和B母液(NaH2PO4 ) 877ml混匀即为1000ml PBS(0.2M,pH6.0);(2)反应混合液配制(以60个样为准):取200ml PBS(0.2M,pH6.0),加入0.076ml液体(原液)愈创木酚(2-甲氧基酚)加热搅拌溶解,冷却后加入0.112ml 30的H2O2,混匀后保存于冰箱中备
13、用。POD反应混合液:3个处理*2个品种*3次重复*3ml*3次测定=162ml(实际配置200ml, 0.076ml, 0.112ml)(3)样品测定:取3ml反应液并加入30l酶液,以PBS为对照调零,而后测定OD470值(测定40秒)。(边加样边测定,测定前等待5秒,动作要快,如果慢的话,要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大)(4)酶活性计算:以每min OD值变化(升高)0.01为1个酶活性单位(u)。POD=(A470Vt)/(WVs0.01t) (u/g min)A470:为反应时间内吸光度的变化;W为样品鲜重(g);t为反应时间(min);Vt为提取酶液总体积(ml,(
14、1.6ml);Vs为测定时取用酶液体积(ml,30ul)。2、 过氧化氢酶(CAT)活性测定(1)试剂配制:0.15mol/L磷酸缓冲液(pH7.0):取A母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和B母液(NaH2PO4) 292.5 ml混合后用蒸馏水定容至1000ml。(2)反应液配制:取200ml PBS(0.15M,pH7.0),加入0.3092ml 30%的H2O2(原液)摇匀即可。CAT反应液:3个处理*2个品种*3次重复*3ml*3次测定=162ml(实际配置200 ml, 0.3092ml)(3)样品测定:取3ml反应液加入0.1ml(可视情况调整)酶液,以PBS为对照调零,
15、测定OD240(紫外)(测定40s)。(4)酶活性计算:以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位(u)。CAT=A240Vt /(WVs0.01t) (u/g min)A240:为反应时间内吸光度的变化;W为样品鲜重(g);t为反应时间(min);Vt为提取酶液总体积(ml,1.6ml);Vs为测定时取用酶液体积(ml, 0.1ml)。三、抗坏血酸过氧化物酶(AP*)活性的测定(缓冲液为K)1、试剂配制(按50个样计算):(1)0.05 mol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH7.0)的配制:(A)K2HPO43H2O:228.220.050.61=6.9607g(B)KH2PO4: 136.090.050.39=2.6538g,以上两者混合起来用去离子水定容到1L。(2)0.1 mM EDTA-Na2:取0.01861g EDTA-Na2用PBS溶液定容到500ml(372.24 g/M0.1mM500ml=0.01861 g);(3)5 mM AsA:取0.044g抗坏血酸用PBS溶液定容到50ml(现用现配,176.13g/M5mM50ml=0.044 g);(4)20mMH2O2:取0.2ml,30%H2O2用去离子水稀释到100ml(30% H2O2为550g30%/(34.01g/M0.5L)=9.703