《临床检测样本RNA提取方法的比较研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《临床检测样本RNA提取方法的比较研究（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、临床检测样本 RNA 提取方法的比较研究摘要：选择市售的三种细胞裂解液（Liaison Plus、Troll Plus 和RNAOUT）和两种 DNARNA共提试剂盒（柱式病毒 DHARNA 双提试剂盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提试剂盒），分别对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）和乙型脑炎病毒（JEV）三种病毒 RNA 进行提取，通过琼脂糖凝胶电泳和 Real-time PCR 间接评价所提取的 RNA 质量。结果表明：对于琼脂糖凝胶电泳，上述三种细胞裂解液和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提试剂盒对应的组均可见清晰且高亮的条带，可用于临床 RNA
2、 病毒检测以及定性分析。对于Real-time PCR，Queasy 快速 DNA/RNA 共提试剂盒 CT 值最低，Liaison Plus、Troll Plus 两种细胞裂解液其次，以上三种试剂可用于临床 RNA 病毒检测以及定量分析。关键词：RNA；提取方法；比较；临床Comparison of Methods of clinical test samples RNA extractionAbstract：Three commercially available cell sates (Liaison Plus, Troll Plus and RNAOUT)and two DNA / R
3、NA co-kits (ALCMENA double-kit, Queasy rapid DNA / RNA co-kit) were selected toextract three animal RNA viruses（PRRSV, CSFV and JEV）. The RNA quality wasevaluated indirectly by agaric gel electroplate and Real-time PCR. The result shows, for agaric gel electroplate, the clearly and highlight bands c
4、an be seen above the groups of the three cell sates and Queasy rapid DNA / RNA co-kit, which can be used for clinical RNA virus detection and qualitative analysis. For Real-time PCR, the CT value of the Queasy rapid DNA / RNA co-kit group is the lowest, and the two cell sates groups(Liaison Plus, Tr
5、oll Plus) followed. The above three reagents can be used for clinical RNA virus detection and quantitative analysis.Key words: RNA；Extraction Method；Comparison；ClinicalRNA 是生物体重要的遗传物质1。近年来，越来越多的科研结果表明，RNA 在生命进程中的作用远不止于此，在 2002 年度 Science 评选的 10 大科学成就中RNA 名列榜首。RNA 分子提取是生物学研究中的一项基本内容，是进行基因表达分析的基础2。对于
6、DNA 文库构建、荧光定量 PCR、CRT、Northern 杂交等下游分子生物学实验来说，都需要质量好的，完整性高的 RNA3。在所有 RNA 试验中最关键的因素是分离得到全长 RNA。分离出纯度高且完整的 RNA 是进行基因表达分析及 RNA 结构功能研究的基础。在所有 RNA 实验中，最关键的步骤是分离得到纯度高且完整的 RNA。，从组织细胞中分离纯粹完整的 RNA 对于分子克隆和基因表达分析等试验是至关重要的4,5Chomsky 和 Sac chi 第一次提出了用异硫氰酸胍法提取细胞内的 RNA6， 使得 RNA 的提取过程变得简便快捷。常见的 RNA 提取方法有强变性剂法7、CTAB
7、 法8、ADS-Phenol 法9以及热硼酸法10等。在商品化的今天，国内外生物试剂公司研发出了许多 RNA 提取试剂盒。比如 Tamara 公司的 Liaison Plus；Inviting 公司的 Tripoli 总 RNA 提取试剂盒以及 Pure Link RNA Mini Kit；上海生工的 UNlQ-10 柱式 Tripoli 总 RNA 抽提试剂盒；Omega 公司的 RNA 小量提取试剂盒（Bacteria RNA kit）以及高纯 RNA 抽提试剂盒（HP total RNA kit）；Engage 公司的 RN easy Protect Bacteria Mini and
8、Midi Kits 等。都可以从病料组织或者培养细胞中快速有效地提取出高质量高纯度的 RNA。实时荧光定量 PCR 的原理是以荧光共振能量转移原理为基础11,12。荧光共振能量转移原理是当一个荧光分子（供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（受体分子）的激发光谱重叠时，供体荧光分 子自身的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。Ct 值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。Ct 值是实时荧光 PCR 中一个很关键的因素，C 代表循环（Cycle），t 代表阈值（Threshold）。每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利
9、用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线13-15。因此，根据荧光探针的发光基团所发出的荧光强度与 PCR 产物的数量呈对应关系，只要对荧光信号进行“实时”检测并获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。与普通 PCR 相比，实时荧光定量PCR 可以利用荧光信号实时监测 PCR 反应过程中每一个循环扩增产物的变化， 可以对初始模板量进行定量分析。简单地说，实时荧光定量 PCR 的基本原理就是样本核酸扩增呈指数增长，在反应体系和条件完全一致的情况下，样本 DNA 含量与扩增产物的对数成正比，由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物（荧光探针）与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增
10、产物量成正比，因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量16-18。大量的研究实验证明：虽然提取 RNA 的方法很多，但是其基本都是把细胞破碎以后，以除去材料中糖、蛋白质、DNA 等杂质为目标。而且材料自身物理化学性质的不同，不同的材料需要不同的提取方法19 ,20。因此，需要通过对比试验，针对不同细胞组织，选择更加合适的 RNA 提取方法。1 材料与方法1.1 试剂高致病性猪繁殖于呼吸综合症活疫苗（JXA1-R 株，中牧实业股份有限公司），猪瘟耐热保护剂活疫苗（成都天邦生物制品有限公司，），日本乙型脑炎弱毒活疫苗（SA14-14-2 株），Troll Plus 总 RNA 提取试剂（南京天为生
11、物科技有限公司），动物 RNAOUT（北京天恩泽基因科技有限公司），Liaison Plus（宝生物工程有限公司），柱式病毒 DHARNA 双提试剂盒（北京天恩泽基因科技有限公司），Queasy 快速 DNA/RNA 共提试剂盒（上海快灵生物科技有限公司），氯仿（），乙醇（），异丙醇（上海申博化工有限公司），逆转录试剂盒（），Mixture（）1.2 总 RNA 提取1.2.1 细胞裂解液法提取 RNA(1) Liaison Plus 法取疫苗稀释液 100L，加 dH2O 稀释到 500uL，加 700L 细胞裂解液；剧烈振荡，静置 515min，充分反应，期间振荡摇匀；加氯仿 200L，剧
12、烈振荡，静置 5min；12000rpm/min，4离心 5min；吸取 600L 上清，加入等体积的异丙醇，沉淀RNA，缓慢摇匀；-20保存 30min 以上；12000rpm/min 离心 15min，弃上清； 加入 400L，75%的乙醇，颠倒 4 次；12000rpm/min 离心 5min，弃上清；12000rpm/min，瞬离，吸干；吹干；每空加入 3040L Release free dH2O，-80 保存备用。其中，疫苗稀释液有三种（PRRSV、CSFV 和 JEV）。每组试验设立三个重复。（2） RNAOUT 法取疫苗稀释液 100L，加 dH2O 稀释到 500uL，加 7
13、00L 细胞裂解液；剧烈振荡，静置 515min，充分反应，期间振荡摇匀；加氯仿 200L，剧烈振荡，静置 5min；12000rpm/min，4离心 5min；吸取 600L 上清，加入等体积的异丙醇，沉淀RNA，缓慢摇匀；-20保存 30min 以上；12000rpm/min 离心 15min，弃上清； 加入 400L，75%的乙醇，颠倒 4 次；12000rpm/min 离心 5min，弃上清；12000rpm/min，瞬离，吸干；吹干；每空加入 3040L Release free dH2O，-80 保存备用。其中，疫苗稀释液有三种（PRRSV、CSFV 和 JEV）。每组试验设立三个
14、重复。（3） Troll Plus 法取疫苗稀释液 100L，加 dH2O 稀释到 500uL，加 700L 细胞裂解液；剧烈振荡，静置 515min，充分反应，期间振荡摇匀；加氯仿 200L，剧烈振荡，静置 5min；12000rpm/min，4离心 5min；吸取 600L 上清，加入等体积的异丙醇，沉淀RNA，缓慢摇匀；-20保存 30min 以上；12000rpm/min 离心 15min，弃上清； 加入 400L，75%的乙醇，颠倒 4 次；12000rpm/min 离心 5min，弃上清；12000rpm/min，瞬离，吸干；吹干；每空加入 3040L Release free d
15、H2O，-80 保存备用。其中，疫苗稀释液有三种（PRRSV、CSFV 和 JEV）。每组试验设立三个重复。1.2.2 柱式病毒 DHARNA 双提试剂盒法提取 RNA在 1.5mL 离心管中加入 100L 疫苗稀释液，加入 600L 溶液 A，振荡 30s 混匀后室温放置 10min（溶液 A 在 4放置后可能产生沉淀，使用前必须放入 65水浴使沉淀彻底溶解并充分摇匀后再取用）；短暂离心后，将 500L 溶液转移到离心吸附柱中，室温放置 2min；12000rpm 室温离心 1min，弃收集管中的的穿透液，把离心柱放回到收集管中；将剩余的溶液短暂离心后全部转移到上一步的离心柱中，室温放置 2
16、min；12000rpm 室温离心 1min，弃收集管中的的穿透液，把离心柱放回到收集管中；加入 700L 的通用洗柱液到离心吸附柱中，12000rpm 室温离心 1min，弃收集管中的穿透液，把离心柱放回到收集管中；12000rpm 室温离心 1min（干甩），弃含穿透液的离心管；将干甩后的离心吸附柱套入到一个自备的 Freebase 的 1.5mL 离心管中，在离心吸附柱的中心加入 3040L 的洗脱液，然后室温放置 2min；12000rpm 离心 1min，离心管中为 RNA 溶液，-80保存备用。其中，疫苗稀释液有三种（PRRSV、CSFV 和 JEV），每组试验设立三个重复。1.2.3 Quea
