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1、L1.配制准备溶液（2015/6/1）一、 实验仪器托盘天平，药匙，100ml烧杯，电磁炉，pH试纸，牛皮纸，橡皮圈，高压灭菌锅，冰箱，移液器，移液枪，低速离心机，1000ml烧杯3个，50ml量筒1个，1000ml量筒一个二、 实验材料葡萄糖5g柠檬酸钠2g柠檬酸1g氯化钠1g蒸馏水3L稀盐酸100mlSPF鸡血 10mlNa2HPO412H2O 5gKCl 1gNaH2PO42H2O 2gNaOH 1000ml三、 实验步骤a) 鸡红细胞保存液（阿氏Alsevers液）配制葡萄糖2.05g柠檬酸钠0.8g柠檬酸0.055g氯化钠0.42g加蒸馏水至100毫升，加热溶解后将pH值调到6.1，
2、经过69千帕，15分钟的高压灭菌，放置在4的环境内，保存备用。阿氏液主要用于保存红细胞，在4的环境下，红细胞可以保存2周而不改变活性和特性。因此阿氏液用于采血、保存和运送红细胞进行化验。 b) 1%鸡红细胞悬液制备 采血用注射器吸取阿氏液1ml，取至少3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液3-4ml，与等量的阿氏液混匀，装入离心管中备用。洗涤红细胞将离心管中的血液经过1500-1800rmin离心8分钟，弃去上清液，在沉淀物中加入本实验要求的PBS液，轻轻混匀，以均匀沉淀的红细胞，在经过1500-1800rmin离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀的红细胞上层的白细胞薄膜，再重复
3、2次以上过程后， 4保存备用。 1%鸡红细胞悬液制备用微量移液器取洗涤后的红细胞沉淀泥0.1ml，加入到9.9ml本实验要求的PBS液，轻轻混匀，制成1%鸡红细胞悬液，备用。c) pH7.2、0.01mol/L PBS的配制i. 配制25PB：称量2.74g磷酸氢二钠（Na2HPO4 12H2O）和0.79g磷酸二氢钠（NaH2PO4 2H2O）加蒸馏水至100mL。ii. 配制1PBS：量取40ml25PB，加入8.5g氯化钠，加蒸馏水至1000mLiii. 用氢氧化钠或盐酸调pH至7.2。iv. 灭菌或过滤。v. PBS一经使用，于4保存不超过3周。vi. PBS对其它酸碱物质具有一定的缓
4、冲能力，维持反应所需的pH，因而比使用生理盐水的效果好。L2.实验仪器消毒一、 实验材料ddH2O二、 实验仪器150*15试管24个（3*7后续使用，3垫脱脂棉装针头），300ml三角瓶3个，镊子3个，眼科剪3个，纱布，报纸，牛皮纸，30ml注射器3个，蓝枪头3盒，黄枪头3盒，白枪头1盒，EP管半盒，盖玻片半盒，烧杯1个（盛EP管），小烧杯一个（盛盖玻片）三、 实验步骤a) ddH2O清洗玻璃仪器b) 包装实验仪器c) 高温蒸汽灭菌（121C，30min）L3.鸡胚发育鸡胚的发育：要采用鸡胚进行细胞培养时，应对鸡胚的发育有一个初步了解。鸡胚的发育是由受精卵开始的，它在通过输卵管时，已开始分裂
5、，当产卵时已在卵黄上部形成一层细胞，名为胚盘，在适宜的条件下胚盘继续分裂生长。在发育过程中由卵黄和卵白中获取养料和水分，由于胚体与卵黄分开的缘故，胚胎只通过卵黄带与卵黄相连。发育的早期形成三个胚层，即外胚层、中胚层和内胚层，由此形成胚胎的各个器官和组织。一般孵育至第3d出现尿囊，为直肠腹侧部分的膨出物，尿囊膜是由内胚层和中胚层构成的。至第45d胚体为羊膜、尿囊膜及绒毛膜层包被。羊膜系由外胚层和中胚层组成，开始时紧贴于胚体上，后来腔内逐渐充满羊水。尿膜在生长发育的过程中，与绒毛膜相连而成绒毛尿囊膜，此膜为三层细胞组成。外层为外胚层，内层为内胚层，中间为中胚层细胞，其中血管甚多有两条主动脉自卵黄囊
6、延伸到此膜中，与此并行有两条主静脉，汇流成一较大的尿囊静脉。绒毛尿囊膜系鸡胚的呼吸器官，位于壳膜之内。此膜生长发育很快，第10d己包围了整个鸡胚，此时鸡胚己出现羽毛，呼吸道的发育在第1215d之间出现。胚胎体积逐渐增大时，胚胎腔外体液亦日趋减少，孵出小鸡时已无胚胎腔外体液。在发育早期，尿囊液及羊水的成分与生理盐水溶液相差无几，12d后羊水的蛋白含量及黏稠度增加，尿囊腔积累了肾脏的排泄物，因此，在12d或13d后，尿囊液由于尿酸盐的存在，使原来透明的液体呈现混浊。尿囊液的酸碱度在712d期间呈弱碱性，在孵育的末期为pH6.0。6-13d鸡胚羊水的平均量为510mL，至13d有时可达10mL。卵白
7、的水分在发育的最初7d中转移到卵黄囊内，在第16d卵臼转入羊水腔为胚胎所吞食。卵黄在发育时逐渐为一层细胞所包围，自12d以后卵黄逐渐干燥，在孵出之后24-48h，整个卵黄囊被吸入小鸡腹腔内，供雏鸡出生后最初几天的营养。L4.鸡胚尿囊腔接种一、 实验材料气管和殖泄道棉拭子，PBS液，链霉素/青霉素，石蜡油，70%酒精，3%碘酊二、 实验仪器试管，100ml量筒，100ml烧杯，注射器，脱脂棉三、 实验步骤a) 病毒采样1. 按链霉素（100g/ml）/青霉素(100U/ml)配制约100ml1XPBS2. 将棉拭子放入试管内，加入适量含双抗的PBS（2/3试管或没过棉拭子）3. 放入冰箱4C过夜
8、4. 将棉拭子中液体尽量挤出，将液体倒入离心管中，2000r/min离心30min，取上清，准备接种b) 接种1. 选用10-11日龄的鸡胚，画出气室和胚位2. 在气室接近胚体处用碘酊和酒精进行消毒3. 用钢锥穿一小孔4. 将注射器沿小孔插入0.5-1.0cm，注入0.1-0.2ml接种物5. 用石蜡封口，并置孵卵箱中孵育，每天翻卵并检卵一次，24h内死亡者废弃，约3d-7d后收获c) 收获1. 收获前鸡胚须置4冰箱6h或过夜，但不能放置时间过长(过长会引起散黄)。如急于收获亦可置-20冰箱lh左右。2. 在气室处用碘酊和酒精进行消毒3. 打开气室顶部蛋壳和壳膜，4. 镊子撕开绒毛尿囊膜5.
9、用无菌吸管或注射器吸取清亮的尿囊液6. 无菌检验，保存尿囊液7. 消毒鸡胚，弃掉注：1. 预冷的目的是，将鸡胚冻死，使血液凝固，避免收获时流出红细胞，并同尿囊液的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。2. 病毒通过胚胎机体后被排泄入尿囊腔，因此当羊水过少时，可用同胚少量尿囊液冲洗羊膜腔并吸取该洗液，-80C保存L4. 鸡胚成纤维细胞的培养一、 实验材料9日龄SPF鸡胚，MEM培养液，胎牛血清，0.25%胰酶，PBS，70%酒精，3%碘酊二、 实验仪器超净工作台、6孔细胞培养板、CO2培养箱，低速离心机，倒置显微镜、移液枪、枪头、离心管（15ml）、眼科剪，镊子，脱脂棉三、 实验步骤a) 鸡胚发育i.
10、 观察方法：将911日龄的鸡胚取出，放人平皿中进行观察。 b) 鸡胚成纤维细胞制备i. 超净工作台紫外线消毒30min，手术器械高压灭菌烘干,胰酶、PBS、细胞培养基等液体水浴锅温度平衡。ii. 消毒：911日龄的鸡胚23个人超净工作台中，大头(气室)朝上放置，先碘酊棉，后酒精棉，消毒气室部位，消毒方式为由内而外，一圈即可，勿反复擦拭。 iii. 取鸡胚：用镊子剥去气室部蛋壳，使用弯头眼科镊撕开气室部位壳膜，弯头朝上，轻轻夹住鸡胚颈部，夹出放入无菌平皿中，无菌操作去头，四肢及内脏，用PBS洗23次，洗去红细胞，吸去液体。 iv. 剪碎鸡胚及清洗：用弯头眼科剪将鸡胚反复剪碎成泥状，加PBS，吸入
11、细胞培养瓶，稍静置，让组织下沉，吸去液体。用PBS洗23次，吸去液体，以去掉红细胞等。 v. 加胰酶：根据组织的多少加入0.25%胰酶，胰酶的量以将组织块浸泡在胰酶中为度，一个鸡胚加0.25%的胰酶23ml。vi. 消化：37水浴消化0.5h，间隔510分钟轻摇混匀。 vii. 洗去胰酶：消化完毕，吸出胰酶，用PBS洗3次以洗去胰酶，吸去洗液。洗时注意轻摇，如猛烈摇动，会将组织块摇散，吸去洗液时，容易将细胞吸去。也可在最后一次，加入小试管1000r/min离心5min，去上清液，。 viii. 计数培养：加入适量的完全培养液(1020mL)，用吸管反复吹打成细胞浓度细胞悬液，用细胞计数法，计算
12、每毫升营养液中的细胞数，根据细胞密度分至培养皿中，培养液的量以覆盖皿底为度。 ix. 放入37、5% CO2温箱培养。培养长成单层细胞，即可应用，这就是鸡胚原代细胞。d) HAa) 抗原效价的测定1. 在微量反应板的1孔12孔均加入25ulPBS液，换滴头。2. 吸取稀释禽流感病毒H5亚型试验抗原25ul加入第1孔，吹吸取1015次混匀。3. 从第1孔吸取25ul病毒抗原液加入到第2孔，吹吸同样次数混匀后吸取25ul加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取25ul弃之，换滴头。4. 每孔再加入25ulPBS。5. 每孔均加入25ul1%RBC液。6. 振荡混匀，在室温（2025）
13、静置40min后观察结果。7. 结果判定：将板倾斜，观察红细胞有无呈泪珠状流淌。完全血凝（不流淌）的抗原最高稀释倍数代表一个血凝单位。结果判定：1、红细胞100%凝集的抗原最高稀释度为血凝价。2、“+”为100%凝集，“+”为不完全凝集，“”为不凝集3、上表例抗原血凝为2564、对照孔的红细胞将成明显的纽扣状沉到孔底 抗原回归实验8. 4单位抗原配制 血凝价数除以42564=64，即 1毫升（抗原）+63毫升（PBS）即成。9. 4单位抗原验证 配制好后和每天应用前都必须对 4单位抗原进行测试验证，操作按表二进行。10. 作两排孔第1-5孔加PBS液25ul11. 第1孔加4单位抗原液25ul
14、，吹吸10-15次混匀吸取，第2孔用同样次数吹吸混匀吸取25ul加入到第3孔，如此进行到第5孔弃去25ul，换滴头。12. 每孔再加入25ulPBS。13. 每孔均加入25ul1%RBC液。14. 振荡混匀，在室温（2025）静置40min后观察结果。结果判定：l 1单位抗原孔的红血球必须达到100%凝集，l 同时0.5孔红血球达到50%凝集，50%下沉孔底才符合要求，否则重新调配。e) HIa) 加PBS液 在微量反应板上的1孔11孔加入25ulPBS，第12孔加入50 ulPBS。b) 加被检血清 吸取25ul被检血清加入第1孔吹吸吹吸取1015次混匀。从第1孔吸取25ul血清稀释液加入到
15、第2孔，吹吸同样次数混匀后吸取25ul加入第3孔，如此进行对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取25ul弃之，换滴头。c) 111孔均加入含4单位抗原液25ul，室温下静置30min。d) 每孔均加入25ul1%RBC液。e) 振荡混匀，在室温（2025）静置40min后观察结果，对照孔红细胞将呈纽扣状沉于孔底。f) 结果判定；以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI的滴度。结果判定： 100%抑制红血球凝集的血清最大稀释度为血凝抑制价 表（三）的血凝抑制价为128。 判定标准：AI血凝抑制价小于或等于8（32）判为阴性；等于16（42）为可疑，需复检；大于或等于32（52）为阳性。免疫荧光检测技术1. 待细胞培养板上的细胞长成单层之后，倾去维持液。2. PBS 洗涤后用- 20 冷丙酮固定5 min10 min，弃去固定液，将96 孔细胞板自然晾干。可立即使用或存于零下20度备用。3. 在96
