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1、动物单克隆抗体的研究和进展【前言】由于B淋巴细胞在抗原的刺激下增殖分化转变为浆细胞产生抗体。每一个B淋巴细胞只能接受单一的抗原刺激产生特异性抗体，从单个B淋巴细胞繁殖的细胞克隆可以得到均质的抗体叫单克隆抗体(monoclonal antibody),B淋巴细胞不能在体外无限增殖。单克隆抗体得特点是特异性强，具有抗原结合位点的特异性；因结合位点的单一性，有时不易捕捉抗原，一株单克隆抗体与抗原不易产生凝集反应或沉淀反应；抗体性质相同，容易纯化、标记。自从1975年Kehler和Milstein利用杂交瘤技术1以来，目前随着分子生物学技术的渗透,出现了各种特异的单克隆杭体,并得到广泛应用，其中包括人
2、源单抗、基因工程单抗、双特异性单抗等同时综述了杂交瘤技术的各个环节在近年来取得的一些迸展,为研制高质量的单抗提供了更为简便而灵敏的手段。各种单克隆抗体不断涌现。研究最为深入的主要有：人-鼠嵌合单克隆抗体、人源单克隆抗体、基因工程单克隆杭体、双特异性单克隆抗体等。单克隆抗体的主要技术有免疫动物脾细胞分离、骨髓瘤细胞的准备、细胞融合、融合细胞的筛选与克隆、单克隆抗体的大量制备等【研究进展】1.1 人源化和人源性单克隆抗体的研究和进展由于嵌合抗体异源性仍然很大，因此需要对鼠源抗体进行人源化改造，进一步人源化的方法很多, 主要是重构抗体和表面重塑技术。重构抗体就是互补决定区(complementari
3、ty determining region, CDR)移植，将鼠抗体的CDR 移植到人抗体的相应部位，这样人源化程度可达90%以上，目前该方法是人源化单抗最常用、最基本的方法。而表面重塑技术，即将鼠抗体框架区表面氨基酸的残基(surface amino acid residues, SAR)进行人源化改造。该方法是仅替换与人抗体SAR 差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换。 虽然人源化抗体解决了鼠抗体的免疫原性等问题，但生产人源化抗体仍有很大的困难；人源化过程需大量繁复、昂贵的电脑模拟，需取代不同的氨基酸以恢复选择性和亲和力，工作量非常大，并
4、且它总还含有少量鼠源性成分。完全的人源性抗体才是用于治疗的理想抗体，目前它主要通过3 种途径来研制：噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术和转基因小鼠制备人源性抗体。 通过免疫的、 天然的以及合成的抗体库展示技术2 或者是利用转基因小鼠3 虽然可以获得人源单克隆抗体， 但是经进一步改造传统的杂交瘤技术 ,所制备的大量鼠源单克隆抗体，仍然是目前开发用于人类疾病治疗的一种可能途径和源头。如若将这些特异性和亲和力较强的非人源单抗进行人源化改造后， 仍然比从头开始以新的靶点来开发治疗性单抗制剂更有应用前景。2006年 Staelens 等用表面重塑的方法改造了抗血管假性血友病因子 鼠单抗 82D6A3 ，将
5、抗体可变区1O个鼠源氨基酸残基替换为人源残基， 获得了很好的结果4。表面重塑技术优于移植重构技术， 在设计人源化抗体时更简单一些， 因为该技术仅需改变表面残基即可，而保留了大量内核的非人源残基。1.2 嵌合单克隆抗体的研究和进展抗体的恒定区是抗体分子结构中免疫原性最强的部位，而决定抗体特异性的是抗体的可变区。从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig 恒定区的基因连接,再插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人- 鼠嵌合抗体。也就是将鼠源性单抗在保留其抗原结合活性的基础上，尽可能的去除鼠源化部分或代之以人源化片断，减少了鼠源性抗体的免疫原性，从而尽可能的减少单抗的异源性，同时保留了亲本抗体特异
6、性结合抗原的能力。但是这种抗体仍保留了30%的鼠源性，可诱发人抗小鼠反应(HAMA)。嵌合抗体用人源抗体恒定区取代鼠单抗恒定区而构建的人-鼠嵌合抗体, 已被证实保留了其亲本鼠单抗的特异性抗原结合能力并能够降低免疫原性, 目前美国正式批准上市的 4个人2 鼠嵌合抗体产品在临床应用中取得良好效果。嵌合抗体就是将非人源抗体可变区移植到人抗体恒定区,仍保留了原来鼠源抗体约 30 %左右的鼠源序列,其免疫原性虽有所降低, 但仍可引起不同程度的 HAMA5应答。无论 CDRs或 SDR s移植所构建的嵌合抗体与其亲本非人源单抗相比,其抗原的亲和力都有一定程度的降低,因为亲本非人源单抗框架区的某些氨基酸位点
7、参与了抗原结合或者对维持抗原结合区构象具有重要作用。同时在对大量的嵌合抗体研究中发现有时其生物学效应并不一定完全与预期设想相符6。 1.3鼠源性单克隆抗体的研究和进展自单克隆抗体制备技术问世以来，制备单抗的一般程序基本相同，从超免疫的供体中即抗原免疫的小鼠，获取脾细胞，再与骨髓瘤细胞融合，最后对单个细胞进行克隆，培养出能分泌单抗的克隆细胞。目前生产的单抗大多是鼠源性的，但其在临床应用方面还存在着很大的弊端，主要是鼠源单抗与NK 等免疫细胞表面Fc 段受体亲和力弱,产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)作用较弱，而且它与人补体成分结合能力低7, 对肿瘤细胞的杀伤能力较弱，并且鼠源性抗体
8、在人血循环中的半衰期短，它发挥ADCC作用的时间较短；其次鼠单克隆抗体还具有免疫原性，使宿主易引起过敏反应。这样一方面降低了单抗的效价，另一方面又会给病人带来严重的后果。因此鼠源性单克隆抗体还应进一步改善才能广泛应用于临床。 1.4杂交瘤技术的拓展 随着杂交瘤技术在生命学科各个领域中应用的不断深入，杂交瘤技术生产单克隆抗体的方法得到了很多改进，人们不断发现单克隆抗体的新用途。其它动物的杂交瘤技术由于人或动物不同类间抗体有排斥反应，80 年代以来，人们在鼠杂交瘤技术的基础上，发展了人源杂交瘤技术，鼠与其他动物包括兔、牛、猪和绵羊的种间杂交瘤。其它动物源的杂交瘤分泌的单克隆抗体特别适合于兽医和食品
9、检验领域中使用。如80 年代中期用EB 病毒转化体外培养的人B 淋巴细胞建立分泌单克隆抗体的细胞系获得成功，为人源单克隆抗体的生产开辟了新的途径。抗体酶技术1986 年，Schultz 等和Tramontano 等发现某些单克隆抗体具有酶的催化作用8，从而为人工设计和生产具有特定催化活性的抗体酶开辟了道路。目前已制备出具有变位酶活性的抗体酶和水解羟基酯、羧基酯、碳酸酯和香豆素酯的酯酶活性的多种抗体酶。 抗独特型抗体的单克隆抗体独特型是指存在于抗体分子可变区及淋巴细胞受体上的抗原决定簇，由独特型抗体（第一抗体）刺激机体产生的抗体（第二抗体）能识别抗原位点的独特型抗体的抗原决定簇，由抗独特型抗体的
10、抗体（第二抗体）刺激机体产生的抗体（第三抗体）能与抗原结合，即与独特型抗体（第一抗体）具有类似性。抗独特型抗体作为一种探针已广泛应用于受体结构和功能的研究，还可用于鉴别和比较特异性抗体分子上的独特型抗体决定簇。 1.5我国单克隆抗体的应用研发进展情况据调查，近年来中国的单抗技术已经受到越来越多的关注和重视，单克隆抗体药物研究已被列入863计划和国家重点攻关项目。目前，中国已有2个治疗性单抗产品获准生产，3个治疗性产品处在临床试验阶段，多个抗体药物处于临床前研究阶段，已批准的诊断性单抗有31个。武汉生物制品研究所抗肾移植单抗OKT3（注射用鼠源性抗人T淋巴细胞CD3抗原单克隆抗体）最早批准上市，
11、具有免疫抑制作用，可逆转对移植器官的排斥反应。东莞宏远逸士生物技术药业开发的生物制品国家一类新药：粤宏远（0573）下属之东莞宏远逸士生物技术药业开发的生物制品国家一类新药“恩博克乳膏”（抗人白细胞介素-8单克隆抗体），用于银屑病（俗称牛皮癣），已于 2001年6月获准生产。上海华晨治癌药业有限公司与美国南加大合作开发的碘人鼠嵌合型肿瘤细胞核单克隆抗体注射液（131I-chTNT），用于多种实体瘤，该药物为国家一类新药，目前已进入三期临床阶段。第四军医大学基础部的国家一类新药碘131I肝癌单抗放免诊断剂和治疗剂，用于原发性肝癌的体内定向诊断及体内导向治疗，也处于临床研究中。该抗体药物的中试生产
12、下游工艺经不断优化，通过使用SREAMLINE扩张柱床吸附技术再配合疏水层析，取得了比传统工艺更为理想的结果【参考文献】1 Kehler G & Milstein C Nature 1975; 256:59-622McCafferty J, GriffithsA D, Winter G, eta1. Phage antibodies： filamentotm phage displaying antibody variable domains JNature 1990，348：552 - 554 3 Green LL. Antibody engineering via genetic engi
13、neering of the mouse：XenoMouse strains are a vehicle for the facile genenalon of therapeutic hu- man monoclonal antibodies JJ Immuno1 Methods 1999, 231：11 - 23 4 Staclens S ，JohanD， NgocTH， eta1Humanization by variable doma i n resurfacing and grafting on a human IgG4，using a new aproach for det-erm
14、ination of non-h u ma n like surface accesiable framework residues based on homology modelling of variable domainsJMolecular Immunology 2006 ， 43：1243 1257 5 Beiboer SHW, Reurs A , Roovers RC, etal Guided selection of a pan carcinoma specific antibody reveals similar binding characteristics yet stru
15、ctural di- vergence between theori ginalmurine antibody andts human equivalent 1 J2. J Mol Bi ology 2000 , 296 :28-49 .6 HolmesM, Foote J . Structural consequences of humanizing an antibody1 J 2. J Immunol 1997, 158: 219-2227 Marks JD , Hoogenboom HR, Bonnert TP , etal By passing immunization humanantibodies from vgenelibraries displayed onphage 1 J 2. JMol Biology 1991 , 222: 25-97 .8 Newman R, Alberts J , Anderson D , etal Primatization of recombinant an ti bodies for immunotherapy of human diseases : amacaque human chimericantibody aga i nst human Biotechnology 1992 , 10: 45-52.
