《抑制性消减杂交 甲基化 miRNA and siRNA Pathways.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《抑制性消减杂交 甲基化 miRNA and siRNA Pathways.doc（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、抑制性消减杂交（SSH）技术服务 1996年，Diatchenko等人发明了SSH技术。该方法运用杂交二级动力学原理（即丰度高的单链DNA在退火时产生同源杂交的速度比丰度低的单链DNA更快），使在丰度上有差别的单链DNA相对含量基本相等。抑制PCR则是利用链内退火优于链间退火的特性，使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发夹的互补结构，从而无法做为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。兼并了消减杂交技术的消减富集和抑制PCR技术进行了高效率的动力学富集的特点：该技术的应用： 比较两个mRNA群体，并获得只在一个群体中过量表达或特异性表达的某个基因的cDNA。我公司采用C
2、lontech公司 PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit构建差减文库，已完成数十个SSH文库的构建（包括植物组织、动物组织、临床样本、微生物等各个种属），积累了丰富的操作经验。欢迎各位老师来电来函，让我们共同学习、共同探讨，为您的研究提供优质的平台服务！SSH 即抑制消减杂交技术是由Diatchenko 等于1996 年以m RNA 差别显示技术为基础建立起来的筛选未知差异表达基因的新技术。它主要基于最近出现的抑制PCR , 并结合标准化(normalization 或equalization ) 和消减杂交( substractive hybridization
3、)。抑制PCR 通过利用含引物序列的双链接头(adaptor) 充当引物模板, 使两端接上同一接头的非目的双链片段具有反向末端重复序列, PCR 中不能扩增, 从而达到抑制非目的片段而选择性扩增目的片段的目的。标准化步骤平衡了目的基因群中cDNA 的丰度, 即低丰度差异表达的基因不会丢失, 而高丰度差异表达的基因又不会被过量分离。消减杂交则扣除了目的基因群( tester) 与驱赶基因群(driver) 间的同源序列。存在于tester 中而不存在于driver 中, 或在tester 中较在driver 中有高水平表达。第一次差减杂交,用过量的drivercDNA分别与tester2adap
4、tor1cDNA和tester2adaptor2cD2NA杂交。分别形成SSH技术原理图所示的tester单链片段a、tester双链片段b、tester2driver同源双链片段c和driver单、双链片段d。根据杂交二级动力学,丰度较高的分子产生同源杂交体(homo2hy2brid)的速度较快,使高丰度与低丰度单链片段a浓度大致相等,从而实现tester单链片段a的标准化6,并使连接一种接头的差异表达基因a初步富集。第二次差减杂交,将上述分别与drivercDNA杂交后的tester2adaptor1和tester2adaptor2cDNA混合,再加入新制备的变性drivercDNA,因t
5、ester2adaptor1和tester2adaptor2cDNA同源,除形成a、b、c、d片段外,又形成了新的连接有两种接头的双链杂交片段e,即连接两种接头的差异表达序列e,是进行PCR指数扩增的模板。PCR之前填补分子粘性末端以利于退火。第一轮PCR,加入针对adaptor1和adaptor2外侧序列的特异引物进行扩增。结果:a、d片段因没有引物结合位点,不能进行PCR扩增;b片段由于两端均为同一接头,具有反向末端重复序列(invertedre2peats),在单链内部形成互补发卡结构的可能性及稳定性均大于引物与其配对结合的可能性及稳定性,故在PCR反应中不能扩增;c片段的一端为一种接头
6、而另一端无接头,只能线形扩增;只有e片段末端有两种不同接头,可通过PCR作指数扩增。第二次PCR,加入一对与接头内侧序列相同的巢式PCR特异引物,进一步富集差异表达序列并降低背景。经过两轮PCR,基于PCR抑制效应的存在,以及选用了两对引物,可以特异扩增代表了差异表达的cDNA片段。经上述PCR所得的差别表达基因片段可以利用接头上存在的酶切位点,插入适当载体,转化细菌。经X2Gal蓝白菌落初步筛选,获得具有差异表达cDNA片段的阳性克隆。然后通过Northern杂交鉴定,cDNA序列分析,可获得一些新的ESTs序列,如进一步对该ESTs进行深入的结构和功能研究,可望获得新的具有重要生物学作用的
7、全长功能基因。甲基化是在DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程。DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式，它不改变DNA的一级结构，却在细胞的发育、基因的表达、及基因组的稳定性中起着重要的作用。CpG岛的高甲基化是肿瘤中存在的普遍现象，而启动子CpG 岛的高甲基化是除突变和缺失外肿瘤中抑癌基因失活的第三种机制。因此，基因启动子甲基化检测在临床诊断（如p16甲基化检测与低剂量CT等相结合）、药物敏感性实
8、验等（如靶向药物）等方面具有很高的应用价值。目前甲基化特异性PCR(Methylmion Specific PCR，MSP)及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法MSP法的原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR)扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。MSP法灵敏度较高，应用范围广。MSP实验流程：难点：1 实验流程长，操作烦琐，不易控制；2 实验操作要求熟练而精细：若起始DNA量太多，则修饰不完全；若量太少，则在修饰、回收过
9、程中易丢失。3 修饰过程，需保证pH值准确，所有试剂要求新鲜配置，需要摸索最适反应时间。4 需对PCR引物设计、退火温度选择、Taq酶及Buffer的选择配置进行优化。MSP法中，影响因素较多。对实验试剂、实验经验和实验习惯都有较高的要求。我公司凭借多年分子生物学实验经验，搭建了稳定的技术平台，积累了数百例MSP成功经验，已经在临床检验方面与多家医院建立了稳定的合作关系！miRNA and siRNA PathwaysmiRNAs are first transcribed in the nucleus as long primary miRNAs(pri-miRNA). While stil
10、l in the nucleus, they are processed into precursor miRNAs (pre-miRNA) by nuclear Drosha, a dsRNA-specific ribonuclease. Pre-miRNAs are subsequently transported from the nucleus into the cytosol by Exportin-5. Dicer (an RNase III-like enzyme) processes the pre-miRNAs into 22 nt mature miRNAs that ar
11、e subsequently incorporated into the RNA-induced silencing complex (RISC). When the RISC identifies the complementary or partially complementary mRNA target, it inhibits gene expression by mRNA degradation or by translational repression.microRNA检测：1、实时荧光定量PCR（Real-time PCR）Real-time PCR技术于1996年由美国Ap
12、plied Biosystem公司推出。该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，与常规PCR相比，特异性更强，自动化程度更高，而且提供了针对PCR污染问题更有效的解决方案。现已成为国际公认的核酸分子定量的标准方法。已经或正广泛应用于分子生物学研究的各个领域，如：DNA定量、RNA定量、SNP分析、基因型分析、RNA变异分析等。2、以RT-PCR方式从组织/细胞中克隆目的基因3、5-RACE, 3-RACE我们在对基因序列进行分析时，一般通过RT-PCR扩增的目的片段，然后进行克隆。但一般的RT-PCR技术，很难从mRNA扩增得到某个基因的全长cDNA片段。cDNA末端的快速扩增（Rapid Am
13、plification of cDNA Ends, RACE）法能有效地解决这个问题。该技术基于mRNA反转录和PCR技术，用部分已知序列为起点，扩增未知序列，从而得到cDNA完整序列。应用： 从有限已知序列获得单个目的基因完整序列 从有限已知序列同时获得一系列基因完整序列 获得未知完整序列：向未知序列中引入已知序列，然后进行RACE4、基因定点突变5、单核苷酸多态性（SNP）检测单核苷酸多态（SNP）是指由单个核苷酸替代、插入或缺失形成的分子形态。有时也包括多个核苷酸插入或缺失造成的点突变。SNP是人类基因组中数量最多的一种多态形式。人类基因组中总共有300万个SNP，平均每1000个碱基中就有一个SNP。其中相当多的SNP位点直接或间接与个体间的表型差异、人类对疾病的易感性或抵抗能力有关。SNP检测在临床及临床相关研究中已有广泛应用。我公司采用Taqman/MGB探针法检测SNP位点。6、慢病毒/腺病毒/腺相关病毒包装及转染7、RNA干扰您只需要提供目的基因的名称、种属等信息，我们为您完成如下实验过程： 干扰序列设计并合成 干扰载体构建 质粒载体大量置备 转染 干扰效果检测（RT-PCR、Western blotting）8、免疫印迹（Western blotting）
