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1、前言：1. 代谢调控发酵技术利用遗传学或生物化学方法，人为在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使目的产物大量生成、积累的发酵2. 代谢控制发酵的核心解除微生物代谢控制机制，打破微生物正常代谢调节，人为控制其代谢3. 改变微生物遗传特性选育组成型突变株（无需诱导物就能生产目的产物） 在诱导物为限制性基质的恒化器中筛选 将菌株轮番在有、无诱导物的培养基中培养 使用诱导性能很差的基质 使用阻碍诱导作用的抑制剂选育营养缺陷型突变株解除反馈作用获得中间产物，给予少量末端产物维持生长，但不足以引起抑制或阻遏反应解除反馈作用的方法： 改变培养环境条件来限制末端代谢产物在细胞内部积累 遗传上改造微生物，
2、使其对末端代谢产物反馈调节作用不敏感选育抗反馈调节突变株 将经诱变处理过的野生菌型菌株涂布在含有末端代谢产物的结构类似物的琼脂平板上，培养一段时间后剩下不受末端代谢产物调节作用的突变株 先除去对末端代谢产物反馈阻遏敏感的酶，使之成为营养缺陷型菌株，再对其诱变处理，使编码该酶的基因发生回复突变，但能与末端产物结合的调节位点不能发挥抑制酶活性的作用选育耐分解代谢物阻遏突变株 以一种能引起分解代谢物阻遏的基质作为唯一氮源，用含这种氮源的培养基的琼脂平板培养筛选经诱变的菌株 轮番让菌株在含有和不含葡萄糖的培养基上生长4. 改变代谢流加速限速反应通过生物合成中间体的分析，找到生物合成的速度限制步骤，外源
3、合成该限速步骤的关键酶基因，并导入细胞内，提高目的产物产量改变分叉代谢途径的流向提高代谢分叉点的某一代谢途径酶系的活力，以得到高产的末端代谢产物构建代谢旁路用代谢工程方法还可阻断或降低合成副产物，特别是有毒产物改变能量代谢途径将血红蛋白基因导入大肠杆菌和链霉菌中，不仅在限氧条件下提高了宿主细胞的生长速率，而且促进了蛋白质和产物的合成延伸或构建新的生物合成途径引入外源基因延伸原代谢途径，产生新的末端代谢产物 第一章 微生物生长与调节1. 微生物的生长形式细菌二等分分裂法阳性：沿细胞上一次分裂周期中形成的中纬带开始；阴性：沿细胞长轴以居间并生的方式合成酵母出芽繁殖两极性：母细胞在两端同一位置萌芽（
4、子母不脱离会形成假菌丝）多极性：母细胞每次萌芽出现在不同位置，如酿酒酵母丝状微生物（霉菌，放线菌）菌丝末梢伸长、分枝和交错成网，称为菌丝体，许多真菌能形成孢子，称分生孢子菌丝生长的主要表现：菌丝伸长，菌丝体干重增加影响菌丝长度的因素：遗传控制与生长环境（深层培养易受搅拌器的剪切作用）调节菌丝球的疏密程度：使菌丝球变密实：过程添加易利用碳源（如葡萄糖），搅拌加快，供氧改善，反之用乳糖，搅拌缓慢，供氧跟不上2. 微生物生长的测量细胞数目的测定（优、缺点，适用范围P6 表1-1）直接显微镜计数、平板活菌计数（稀释培养法）、自动细胞计数和分检法细胞总量的测量直接：细胞干重测量法（DCW）、比浊法、离心
5、压缩细胞体积法（PCV）间接：营养物质消耗的测定、测量产物的形成、发酵热、测定细胞组分代谢产物： 细胞组分在胞内浓度应相当一致 在定量萃取与分析方面应当相当精确 非细胞固体中是否也含有同样的组分，细胞中此组分的含量与细胞量的关联营养消耗： 细胞得率是否稳定（高低） 养分测量方法准确性 是否存在干扰分析的物质，量有多少Monod方程： = mS/(Ks+S)V = VmS/(K+S)用以描述生长速率与基质浓度S间的关系，是经验公式，而米氏方程由理论推导得Ks：营养物质的饱和系数，为=0.5m时的营养物质浓度，衡量微生物对某种限制性营养物质亲和力的大小，Ks越小，说明微生物对该种营养物质的亲和力越
6、大Ks=100300mg/L（被动扩散，异化扩散）；Ks=1100mg/L（载体介入，主动运输）S：营养物质的浓度，能否用测定细胞组分法估算生长取决于： 非细胞性固体中是否含有此组分，如有就不能用此组分与细胞生长相关联 细胞中该组分与细胞量间是否有定量关系、这种定量关系是否恒定微生物生长与环境的关系温度：菌在低于最适生长温度的温度范围内比在高温度范围内有更强适应力一种对生长必需的酶的改变会使生长对热变性比野生型更敏感；温度降低细胞脂肪酸不饱和程度增加；随温度升高，死亡速率的增加远大于低活化能的生长速率的增加与其细胞膜结构的物理化学特性有密切关系；与其细胞内某些关键酶的活性有密切关系影响微生物比
7、生长速率；影响生物合成的方向；温度影响碳源的基质得率水活度：水对细胞的影响，Aw=ps/pwps和pw分别为溶液和纯水在同一温度下的蒸汽压；Aw相当于相对湿度。同温下纯水的Aw=1细菌比霉菌对水活度更敏感；G+比G-更能耐受低水活度pH值的影响：细胞本身、细胞膜电荷状况，引起膜渗透性改变、对物质的吸收和分泌影响营养物质溶解度，pH：CO2溶解度下降，Mg2+、Ca2+、Mo2+溶解度上升，达一定程度后会对细胞产生毒性；pH：Fe2+、Mn2+等溶解度下降，以碳酸盐、磷酸盐或氢氧化物形式沉淀下来是微生物生长和产物合成的重要状态参数，上升超过最适值，意味着菌处饥饿状态，可加糖调节基质基质抑制：所有
8、营养物质都有上限浓度，超过该浓度，浓度继续增加会使生长速率下降抑制是由渗透压所致，溶质浓度增加到一定程度细胞会脱水，进而降低生长速率3. 生长效率得率系数：假定所利用的基质与生成的细胞之间的固定化学计量关系表示生长得率的方法： 分子得率系数：每消耗1mol基质所生成的细胞量，用于比较不同基质的转化率 碳转化率：指基质中的碳有多少转化为细胞的碳碳转化率（CC）=Y （DCW中的碳含量/基质的碳含量100%）。只适用于基质为唯一碳源的情况 基于热产生的得率Y kcal：单位释放的热所产生的细胞量。Y kcal=产生的细胞量/释放的热 基于ATP消耗的得率YATP = 生成的细胞/消耗单位摩尔的AT
9、P可用来区分厌氧微生物的葡萄糖代谢主要途径决定生长得率的因素：微生物的遗传性质；基质的性质；基质的分解代谢途径；菌的生理状态维持能：指分解代谢产生的用于非生长活动的能量，生长环境越远离最适生长条件，维持能越大第二章 微生物的基础代谢在代谢过程中，凡能释放能量的物质的分解过程都叫分解代谢；吸收能量的物质的合成都被称为组成（合成）代谢。二者合称新陈代谢（基础代谢）1. 能量代谢原理光养菌：直接从光能获得营养化能营养菌：利用光养生物已合成的富能化合物异养菌：有机碳作为碳源自养菌：细胞中的碳大多来自于CO2的固定营养缺陷型：培养基中需加入它们不能自己合成的有机化合物才能生长的菌能量的产生：氧化还原反应
10、。能量通过一些高能化合物以高能键形式储存，此化合物称能量载体能量偶合：一种能量上可行的反应推动另一种在能量上不可行反应进行的过程。分两种：有能量转移、无能量转移。 单酶催化单一反应 多酶反应 无能量转移偶合反应三种磷酸化方式：基质水平磷酸化（可溶性酶酶催化基团转移）；电子输送磷酸化（膜酶催化氧化还原）；光和磷酸化（膜酶催化光能转换）能荷 =（ATP+0.5ADP）/（ATP+ADP+AMP）作用：有助于检测一已知细胞生长期间的能量变化及酶活相应变化，细胞停止生长时能荷最高2. 微生物分解葡萄糖的途径糖酵解途径（EMP）一分子葡萄糖净生成两分子ATP+两分子NADH；葡萄糖活化需消耗一分子ATP
11、，一磷酸果糖生成二磷酸果糖需消耗一分子ATP；磷酸丙糖氧化生成一分子NADH，丙酮酸生成一分子NADH关键酶：6-磷酸果糖激酶，终产物：丙酮酸己糖单磷酸支路（HMS）（存在于哺乳动物、酵母、细菌中）一分子葡萄糖消耗一分子ATP生成两分子NADPH。终产物：三磷酸甘油醛5-磷酸核糖合成嘌呤、嘧啶核苷酸，4-磷酸赤藓糖合成芳香族氨基酸前体关键酶：6-磷酸葡糖酸脱氢酶，终产物：三磷酸甘油醛，6-磷酸果糖HSM途径的重要性在于它能提供合成核酸和吡啶核苷酸等1所需的戊糖和合成芳香氨基酸和维生素所需的前体以及许多合成反应所需的（NADPH+H+）恩特纳-多多罗夫途径（ED）（严格需氧菌，除运动发酵单胞菌）
12、关键酶：2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸（KDPG）醛缩酶，终产物：丙酮酸，三磷酸甘油醛磷酸解酮酶（PK）途径（只存在于少数种类细菌中，厌氧条件下）每分子葡萄糖净得一分子ATP。关键酶：磷酸解酮酶，最终产物：乙醇或乙酸（ADP ATP）磷酸己糖解酮糖酶途径（HPK）三羧酸（TCA）循环（柠檬酸循环/Krebs Cycle）将丙酮酸完全氧化为CO2和水，脱氢反应中从基质取得的电子被送到呼吸链中去，在那里产生所需ATP。对生物合成极其重要，它提供一些氨基酸生物合成的前体；如-酮戊二酸和草酰乙酸分别为谷氨酸和天冬氨酸的前体三羧酸循环补给反应系统因TCA循环所有反应过程均需同时进行，要从TCA循环中抽
13、出一些前体就必须及时补充抽走的中间体，循环才能继续运行 丙酮酸+CO2+ATP 草酰乙酸+ADP+Pi（丙酮酸羧化酶+生物素） PEP+CO2 草酰乙酸+Pi（PEP羧化酶） PEP+CO2+ADP+Pi 草酰乙酸+ATP（PEP羧化激酶） PEP+CO2+Pi 草酰乙酸+ATP（PEP转羧磷酸化酶） 丙酮酸+CO2+NADPH+H+ 苹果酸+NADP+（苹果酸氧化脱羧酶）不是所有这些反应都存在于同一微生物中，PEP羧化酶广泛分布于细菌中，而丙酮酸羧化酶分布于酵母中。TCA循环因而有无定向功能循环之称乙醛酸循环（碳源：乙酸）TCA循环增加异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶，补充C4-酸，避免生成CO2
14、，丢失碳架乙酸 乙酰CoA 苹果酸 草酰乙酸 PEP 6-P-果糖 3. 氨基酸合成 谷氨酸合成合成一分子谷氨酸需要从TCA循环中抽出谷氨酸的碳架-酮戊二酸，然后通过补给反应从丙酮酸羧化补充一分子草酰乙酸天冬氨酸合成天冬氨酸是通过转氨作用由草酰乙酸合成的，将天冬氨酸进一步氨化可得天冬氨酰胺赖氨酸合成所有原核生物，高等植物和菌类的赖氨酸生物合成途径称为二氨基庚二酸（DAP）途径真菌和一些眼虫藻的赖氨酸的生物合成途径称为-氨基己二酸（AAA）途径原生动物不能合成赖氨酸，需要从外界摄取。DAP途径具有两个特殊功能的中间产物：二氨基庚二酸和双氢吡啶二羧酸。前者是细胞壁的肽聚糖组分；后者是吡啶二羧酸的直
15、接前体，它是内生孢子（芽孢）壁的主要化学成分，赋予芽孢热稳定性芳香族氨基酸合成（莽草酸途径）酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。它为叶酸和对氨苯甲酸与苯醌分别提供合成前体分支酸和对羧基苯甲酸4. 微生物同化氨的三种方式 -酮戊二酸+NH3+NADH+H+ 谷氨酸+NAD+H2O （谷氨酸脱氢酶） 谷氨酸 +ATP+NH3 谷氨酰胺+ADP+Pi（谷氨酰胺合成酶） 天冬氨酸+ATP+NH3 天冬氨酰胺+AMP+ ppi（天冬氨酰胺合成酶）微生物同化氨的途径取决于胞内氨浓度以及其遗传特性。5. 腐胺（丁二胺）生理学意义调节渗透压、保证微生物细胞内部的离子强度大致不变细胞内腐胺浓度变化与培养基的渗透压成反比能耐渗透压越强的细菌，胞内的K+ 强度越大。培养基的渗透压增加，胞内的渗透压也随K+
