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1、质粒转化步骤SOB 培养基（用于菌种扩增）胰化蛋白胨 20g酵母提取物 5gNaCl 0.5 gKCl 0.186gMgCl2 0.95g用去离子水定容至1L,在121C高压下蒸汽灭菌20min。琼脂SOB培养基（用于制备固体培养基）胰化蛋白胨 20g酵母提取物 5gNaCl 0.5 gKCl 0.186gMgCl2 0.95g 琼脂粉 15g用去离子水定容至1L,在121C高压下蒸汽灭菌20min。SOC 培养基（用于菌种复苏）除含有20 mmol/L的葡萄糖外，其他成分与SOB培养基相同。SOB培养基经高压 蒸汽灭菌后，让其冷却至60C或60C以下，加入20mL无菌的1mol/L葡萄糖（该
2、 溶液的配方是将18g葡萄糖溶解于90mL去离子水中。待完全溶解后，用去离子 水定容至 100mL, 0.22um 滤器过滤除菌）。操作步骤：1. 从-70C冰箱中取出一管感受态细胞。用手掌握住小管解冻细胞。待细胞解冻后， 将小管转移到冰浴中。将细胞置于冰上 10min。2. 使用预冷的无菌吸头将感受态细胞转移到预冷的 1.5ml 聚丙烯管。加入转化 DNA（每50 UL感受态细胞中最多加入10ng）,体积不超过感受态细胞的5%。轻 轻旋转小管多次，混匀。将管子置于冰上30m in。将细胞置于冰上应避免使用玻 璃管，因为它们可降低约10倍的转化效率。注：细菌转化必要的对照在每次实验中应设有阳性
3、对照，以测定转化效率；并设 置阴性对照，以排除污染的可能性，以及确定实验失败的潜在原因。阴性对照：转化实验中设置一份感受态细胞不添加DNA。将此份细胞平铺于一个 含有适当抗生素的、用于筛选转化体的琼脂平板上。此平板上应该无茵落长出， 没有涂布细菌的选择性平板也应如此。如果有茵落长出,考虑以下可能性。a 在实验过程中感受态细胞被具有抗生素耐药性的细茵菌株污染。可能转化方案 中使用的溶液/试剂被污染。b 选择性平板有问题。可能是忘记了在平板中添加抗生素或者加入抗生素时琼脂 太热。c 选择性平板被具有抗生素耐药性的细茵菌株污染。在这种情况下，菌落通常同 时出现在培养基的表面上和琼脂中阳性对照：用已知
4、量的、标准制备的环状超螺旋质粒DNA转化一份感受态细胞 此对照将测定此次转化的效率，并提供了与以前的转化实验相比较的一个参照）。3. 将管子置于预热的42C水浴中，若质粒大于8000bp，热激90s，如果小于 8000bp，热激60s。热激过程中不要摇动管子。热激是至关重要的一步，细胞以 适当的速率上升到正确的温度是非常关键的，热激的时间一定要严格控制。4. 迅速地将管子转移到冰浴中，使细胞冷却 12min 。5. 每管加入800 口 L SOC培养基（无氨苄）。在水浴中将培养物加热到37C，然后 将管子转移到振荡培养器中37C培养45min,使细菌复苏并表达质粒编码的抗生 素抗性基因。6.
5、将合适体积（至多200 口 L/90mm平皿）的转化感受态细胞转移到含20 mmol/L MgSO4 和合适抗生素的琼脂 SOB 培养基中。采用玻璃曲棍球棒或玻璃珠法使菌 液均匀涂布，玻璃珠法操作如下：a. 提前将玻璃珠转移到聚丙烯管中，每管4 6个。高压灭菌消毒珠子。b. 当接种物转移到琼脂平板后，打开一管无菌的玻璃珠，并将玻璃珠倒到平板上c. 缓慢地来回摇动平板，每隔几秒钟将平板旋转大约90,目的是让玻璃珠按平 板的直径方向运动，而不是环绕其周边。d. 持续摇动23min。如果平板是叠置的，几个平板可以同时摇动。e. 平板充分摇动后，将平板倾斜到一侧去除玻璃珠，打开盖子，将玻璃珠倒入含 洗
6、涤溶液的烧杯中。f. 收集到足够多的脏玻璃珠时，可以用去离子水洗涤，高压灭菌并重复使用。当采用氨苄青霉素筛选时，转化细胞应以低密度（小于104菌落/90mm平皿）平铺， 并且平板在37C解育不应超过20h。氨苄青霉素抗性的转化体产生的B-内酰胺 酶分泌到培养基中,可以迅速使菌落周围区域的抗生素失活。因此,铺板密度过高 或孵育时间过久会导致氨苄青霉素敏感的卫星菌落产生。在选择性培养基中使用 羧苄青霉素而不是氨苄青霉素，并且把抗生素浓度从60 口 g/mL提高到100 口 g/mL，该问题可以得到部分改善，但不能完全消除。氨苄青霉素抗性菌落的数 量并不会随着铺板的细胞数目呈线性增加，这也许是由于抗
7、生素杀死的细胞释放 出的生长抑制物质造成的。7. 在室温下放置平板直至液体被吸收。8. 将平板倒置并在37C孵育。转化后单菌落应该在1216h出现。9. 挑取单菌落，可依据获取质粒的数量来选择不同规格的容器进行摇菌。于摇床 37C， 180r/min 进行摇菌。 12-16 小时可用于质粒提取，同时可以进行保菌。保 菌方法如下：a液体培养基生长在平板上或液体培养的细菌可在含15%无菌甘油的SOB培养基 中保存。制备成 1mL 一份的含有甘油的 SOB 培养基，为确保甘油均匀分布需涡 旋振荡。-20C或-80C保存。b菌株也可以保存在LB冷冻缓冲液中（LB冷缓冲液并不是LB培养基，两者成分 完全不一样）。LB冷缓冲液配方如下：无水 K2HPO4 36mmlo/LKH2PO413.2mmlo/L柠檬酸钠1.7mmlo/LMgSO4 7H2O 0.4mmlo/L 硫酸铵6.8mmlo/L甘油4.4%用去离子水定容至1L,在121C高压下蒸汽灭菌20min。
