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1、生物迷：介绍点我的经验：真菌大多悬浮于液体表面,如果发现有少量真菌污染可用大量PBS或D-HANKS冲洗,加含有双抗的培养基培养观察3天,然后看有没有真菌.我用这种方法救了一瓶非常宝贵的细胞(用GIBCO胎牛血清外加FGF-2培养了一个月的MSC).seaman_wang：如果你霉菌污染，有两种方法，一种是你制备一些小鼠的饲养细胞加入板上，一起培养，让饲养细胞中的巨噬细胞吃到霉菌。第二种，在培养基中加入制菌霉素。PINX：是真菌污染，可以用两性酶素B试试看，不要用国产的，因为试剂不纯，有较大毒性，GIBCO有商品化的两性酶素，我师妹用过效果不错。heimukai13：请问:我先配置DMEM,然
2、后过滤,吸3ml检菌三天,若无菌,添加FBS和双抗,过滤后贮存备用.(不知这样对否?因为我是从别的实验室学的,我连续几次配,检菌时都发现培养基表面有一层薄薄的如雪花形状的东西,它在配完培养基第二天下午六七点还看不到,而到九十点就能看到好多,非常迅速,但往后几天却又不怎么长了,培养液一直是清澈的,很纳闷,不知是什么东西,)若配置DMEM后不检菌,而直接加FBS和双抗,成为全培养基,过滤备用,可以吗?asd1191：双抗要在配DMEM时就要加，然后过滤！过滤后最好在DMEM中加一点血清在培养，这样长菌的话快！过滤前是不加血清的，因为血清是很难过滤的！培养基表面的如雪花形状的东西可能是长菌的，你摇晃
3、一下瓶子，若浑浊了，则很有可能污染了！另外培养基最好不要反复过滤！这样营养成分会丢失的！另外反复过滤的话会偏碱！heimukai13：哦,原来要先加双抗的!加了双抗,还需要检菌吗,我想一般就生不了细菌了吧!我不加血清都有漂浮物了,会不会是真菌呢,是的话,怎么防止呢?那些雪花状的东东,摇一下,还是在表面荡来荡去,培养液清澈.(见图)我过滤加FBS后的培养液很好过滤的!怎么回事呢? hualey：加双抗也只是防止一般染菌，但像支原体等污染就很难起作用，所以加了双抗之后还是要验菌的。感觉你那东西像染菌，因为1）你没加双抗；2）开始没有，第二天才出现（除非你的培养基pH发生大的变化，一般不可能）。鉴于
4、你每次都出现这种情况，你是否可考虑环境或操作有问题，你也没说具体，所以只能作为建议。小牛血清不好滤是相对的，我滤过小牛血清，只是比不加血清的培养基难滤，有时含血清培养基用久了，我还用滤器滤过呢！heimukai13：我第一次配时没有发现这种情况,后面三次操作都一样,而且用的都是刚灭过菌的东西,而出现照片上这种东西了,会不会是培养液里的氨基酸什么的析出来了呢,因为这雪花样东西过上几天还是这么多,是菌的话应该长疯了吧!而如果是支原体的话,应该肉眼看不见的了.scp：应该不是氨基酸析出，若是氨基酸析出的话沉淀是在底部的。漂浮在上面会不会是霉菌呀？你有没有用这种培养基养过细胞呀？不妨尝试一下看看有没有
5、污染，如果没有污染的话，大可继续使用。还有。双抗一定要在过滤之前就加上，血清最好也是这样（虽然过滤速度会慢一些）。heimukai13：应该不是霉菌吧,霉菌是丝丝连连的,绒球球样,长起来好多就悬浮在培养液里了,有一瓶细胞曾经污染过,这个就不一样了!我试试看用它来培养细胞!朱晶：双抗一定在要滤之前加，对于DMEM培养基我建议在-20冻存后，如果想用最好提前一天化出来，放到4度里放一天再用，这样比较好，因为这种培养基极愿意产生一些析出物，放置一天会就会溶开了。而且我觉得血清最好还是不要过滤，里面含有一些大分子的营养成份，如果过滤的话对血清本身来说是一种损失。szmengjie：我第一次培养T淋巴细
6、胞，加了PHA刺激其生长。发现显微镜下它们长得特别快，昨天还是密度适中的圆圆，亮亮的小豌豆一样的游离的细胞。细胞中间有些聚集成团的颜色较深的象一堆血小板一样的东西。今天一看，已是长得平铺了一视野的密密麻麻的看不出单个细胞的形态，大小。呈向心性分布，即中间密度尤高，而越到边缘，则稀疏点。在稀疏处可看到圆圆，亮亮的小豌豆一样的游离的细胞。肉眼培养液里有白色絮状物。白色絮状物究竟是污染还是细胞数太多？菊花与刀：是不是霉菌感染呢，我前段时间培养的细胞最后就是感染霉菌了，就是一团一团的漂在上面，中间密度高，周围稀疏，高倍镜下可以看到菌丝。szmengjie：我想霉菌污染是有可能，我用的是24孔培养板，因
7、为标本是断断续续地来，一次只能用其中几个，将那些细胞悬液吸走后，因还有没用过的孔，舍不得丢掉培养板。过一天，看那些曾用过的孔，孔底部长出象雪花一样的，也可说象海藻一样，每个枝象细胞生物学上分子筛的图像一样。我想问：1 细胞太多能出现白色沉淀吗？2 霉菌污染除开看到菌丝，还有其他方法证明其存在吗？早期有什么补救措施吗？3我对细胞培养时出现的污染实在没有概念。有没有哪里提供图谱，让我们这些新手认认敌人的面貌呢？culture-spirit：1、可以，镜下可见此处细胞程大团分布2、如果霉菌污染已经到了出现白色沉淀的时候，一般能够看到菌丝了，镜下相当明显3、这个我也没有找到，好象一些细胞培养的书付页里
8、有，可以请教其他战友qjzhou2000：1、不会是 沉淀的，仔细看应该还是可以看到细胞形态的，你用的是不是olmpus的相差境？那种倒置境的相差效果很好，细胞看起来有点象珍珠。2、霉菌看到菌丝的时候就很厉害了，早期不容易发现，可以加两性霉素之类的抗霉菌的抗生素，具体请在该区搜索，很多都讲到了。3、现在还没找到，不过一些描述还是很直观的。midas：细胞数太多会出现片状的脱落，所以白色絮状物污染的可能性大些！独上高楼：霉菌污染后细胞多生长很慢，象你这种情况，细胞一夜就长满，霉菌污染的可能性不大。另外，霉菌污染也不能一下就看出白色絮状物，而是先在镜下看到较稀少的短小黑色分枝串珠，再看到较密集的短
9、小黑色分枝串珠，最后才能肉眼看到白色絮状物，这个过程大约要1个星期左右，而且在这期间细胞几乎不生长。szmengjie：前段时间我老被这种在细胞培养液中白色的象一片白膜的东西困扰。40倍镜下同“细胞污染讨论区”贴出的图片一样。上周我送了个培养，结果证实是真菌污染。显微镜下（100倍油镜）染色后可见到一颗颗象红色的南瓜子一样的东西（真菌孢子）。据细菌室的老师说还可在这些“红南瓜子”间见到丝一样的东西。可能就是菌丝了。我已经非常注意实验器材的消毒灭菌，操作应该也没问题。于是将试剂一个一个吸取了放在显微镜下观察，发现是洗细胞的HANKS液被真菌污染了!现在我已经换了HANKS液，这种污染可以说被控制
10、了。yoyo781206：我想应该是污染了，因为我也遇到过，过几天就看到放射状的菌丝了topgun：象霉菌的菌丝，但应该观察其数量是否增多？因为霉菌污染在2-3天内可见大量的菌丝！如果是不小心带进去的棉絮则不会有数量的增加且培养基也不会变混浊。yuandong：我想应是霉菌，白色，絮状，培养基变成了黄色。apple800828：不象霉菌污染。前两天我培养的内皮细胞被霉菌感染了，好典型的树枝分叉样。象抽丝一般。chenting100：是霉菌，我们的细胞就经常出现这种污染，实验室老师说霉菌有好多种变异呢。huvec：其中有多细胞真菌污染的特征性标志：菌丝！wujinghui：我得细胞培养液中不知道
11、是什么东东，它漂浮生长，在瓶底是白色的，在低倍境下就能看到，在培养瓶里边呈葡萄状，还有的呈树枝状，刚开始时候生长的不快，但是很快就长得很快。不知道这个东西是什么东西，英文名字怎么写，最好能告诉以下如何控制！ya2cyto：霉菌感染。霉菌是以孢子在空气中传播，细胞肯定是不能要的了，一旦污染很难控制用环氧乙酸熏蒸培养箱，最后再对培养箱进行无菌实验方可使用wujinghui：不是霉菌，因为霉菌不用显微镜就能看得到的 。我这个不用显微镜是看不到。shyaroom：不信？你再放个三天，肯定就能用肉眼看到啦，呵呵。不过建议你换个地方放，别把其它细胞再给污染了。ylh1976：霉菌，树枝状的东西是菌丝，葡萄
12、状是霉菌。赶紧处理掉细胞，培养箱、操作台还有整个培养室好好消毒一下。梅雨季节要千万小心，空气中到处都有霉菌孢子。深谷幽兰：各位，有时鸡胚成纤维细胞也连在一起，呈树枝分叉状，而正常的细胞单个散在，这是怎么回事？junny999：我的一个同事养的细胞被霉菌污染，我与她共用一个培养箱，为防止交叉污染，我想在我的培养基里加点抗霉菌的药，请教加哪一种药物比较好？剂量怎样添加？我养的是MSCXTYang：Invitrogen公司的Fungizone, 1%(v/v)的用量。对有些细胞有毒害作用。renjiaqiang：我觉得你最好不要加，我加过抗霉菌药物后细胞生长很慢，而且形状也发生改变，不得已重新买了一
13、株细胞，你现在可以先把细胞冻存，将培养箱消毒后继续进行实验。lingzhiting：最好不要用吧！我用过nystatin，40Iu/mL。霉菌没长起来，不过也许是不溶的缘故，细胞生长很慢，而且还引入了不明杂质，洗了几次，才逐渐洗去。wuguojun680510：如果没有长真菌就不要加抗真菌药物，因抗真菌药物有较强的细胞毒性，加了结果会适得其反。最好能把环境处理一下。qianyimei：星期一复苏了一支细胞株，养到星期三还好好的。心太急。老希望它能长的快些，所以，将一瓶配成三瓶用，结果倒好，今天早上一来，就发现里面长了很多成团的碎片状的东西，众师兄都说是霉菌，叫我倒掉，好可惜，好郁闷！早知道就不
14、换液了，这一换，全军覆没。那位能有更好的办法吗。zhaoqingshan：用含双抗的PBS洗几遍，换上好的培养液（比如用点好的胎牛血清）；每天洗1-2次，只要细胞状态还好，洗几天，就能把霉菌去除。然后，检查霉菌污染的原因，清除污染源。zjuaxiu：根据经验霉菌污染了用双抗的pbs冲洗基本是没什么作用，只能是浪费双抗pbs时间zhaoqingshan：那只是说明你的经验，不巧的很，我的细胞(细胞很娇贵，培养液价值约10元/ml)去年七月霉菌污染了一次，全部抢救过来。不可否认很多时候是抢救不回来，前提条件是早发现污染，霉菌对细胞还没有构成太大伤害时候，是可能抢救回来的。当然，最重要的是不要有污染
15、了，预防最重要，即无菌观念要强。flyingpumc：用3微克每毫升的两性霉素杀杀试试!eweiren：如果不是唯一的一管细胞，我觉得没有必要费这么大力气去挽救，因为有了霉菌，基本上是无法去除的，通过换液只能达到抑制真菌的生长，在镜下看不到不代表不存在，只是由于少或者芽孢看不到，一段时间后它可能还会出来，耽误试验啊！zhaoqingshan Re:碧海娃娃双抗PBS是指含有双抗(青链霉素)PBS（磷酸盐缓冲液，也不能杀死霉菌，杀霉菌应该用两性霉素或制霉菌素），使用双抗PBS冲洗仅仅是预防其它细菌的污染而已。Re:eweiren ，你说的是很对的，真正严格的实验是不应该有污染的。细胞株拿来后，传
16、代几次，细胞多了，就应该冻存一些，一方面以免细胞传代次数多了变成非二倍体或者其它变异，另外就是以防污染。如果自己培养的原代细胞，可以挽救一下试试，大部分情况是难以回天的，看运气了。不过，我那次污染正是霉季，一般实验室在这个时候，可能就不养细胞了，我们实验室是我们院里无菌观念最严格的一个实验室，在这以前，细胞从来没有污染过。那时候可能是因为空调很久没有擦洗消毒了，而我又太大意，因此感染霉菌了。不过，那次我还真的就救回来了，因为我的培养液中，营养条件特别好，而且我每天洗几次，换液，细胞没有任何的受影响的表现，我做的是原代细胞传代到第三代，刚好该做实验，因此就全部用来做了同一批的实验。避免真菌污染的几个措施：1、严格的无菌操作;2、无菌间定期打扫、消毒，保持干燥；3、各种培养液、培养器皿的严格消毒；4、温箱中消毒水中放置过饱和的消毒的磷酸氢二
