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1、实验六 蛋黄总胆固醇的测定（邻苯二甲醛法）一、实验目的1、学习分光光度计的原理及操作。2、学习用分光光度法测定蛋黄中总胆固醇（脂肪）含量及标准曲线的制作。 二、基本原理胆固醇及其酯在硫酸存在下与邻苯二甲醛作用，产生紫红色物质，此物质在550nm由最大吸收值，可用比色法测定。胆固醇含量在400mg/100ml之内与吸光度呈现良好线性关系。本法操作简便，灵敏、稳定。实验相关原理根据物质对光的吸收特征和吸收强度，对物质进行定性和定量的分析方法，称为分光光度法(spectrophotometry)。该法具有一定的灵敏度和准确度，分析手续较简便快速，仪器设备也不复杂，故应用很广。 吸光度与液层厚度和溶液
2、浓度的乘积成正比，称为朗伯比尔定律，简称比尔定律，即光的吸收定律。 吸光系数的大小，取决于物质(溶质、溶剂)的本性和光的波长。 1. 物质不同，则吸光系数不同，所以吸光系数可作为物质的特性常数。在分光光度法中，常用摩尔吸光系数来衡量显色反应的灵敏度，值越大，灵敏度越高。 2. 溶剂不同，其吸光系数亦不同。3. 光的波长不同，其吸光系数亦不同。如将不同波长的单色光依次通过被分析物质，分别测得吸光度，然后绘制吸光度波长曲线，称为吸收曲线(absorption curve)，吸收曲线上有极大值的部分，称为吸收峰。吸收峰所对应的波长，称为最大吸收波长，以符号max表示 ，这是物质定性的依据之一。4.单
3、色光的纯度也影响吸光系数。单色光越纯，即经单色器分光后的波长范围越窄，其吸光系数越大。定量方法：1、吸光系数法 2、标准曲线法 不是任何情况下都能适用的。特别是在单色光不纯的情况下，测得的吸光度值可以随所用仪器不同而在一个相当大的幅度内变化不定，若用吸光系数换算成浓度，则将产生很大误差。 先配制一系列浓度不同的标准溶液，在测定条件相同情况下，分别测定其吸光度，然后以标准溶液的浓度为横坐标，以相应的吸光度为纵坐标，绘制AC关系图，在相同条件下测出样品溶液的吸光度，就可以从标准曲线上查出样品溶液的浓度。 3、对照法 标准曲线的制作（1）配置一系列浓度不同的标准溶液。（2）在测定条件相同的情况下，分
4、别测定其吸光度。（3）以标准溶液浓度为横坐标，以相应的吸光度为纵坐标，绘制A-C关系图。（4）在相同条件下测出样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出浓度。定性方法： 将一系列不同波长的单色光，照射到含待测组分的溶液，可测得相应的一系列吸光度。如果以吸光度为纵坐标，以波长为横坐标作图，便可得到该待测物质的吸收曲线。由于每一种物质均有其特征的吸收曲线，故可与其标准品比较而定性。但在实际工作中常用max 和来定性，max可从吸收曲线中吸收峰所对应的波长直接找出；通常需配制待 测物质三种不同浓度的溶液，于1cm吸收池中，在max处分别测定其吸光度，根据A=bc，即=A/bc，计算出，将三次结果平均，即得该
5、物质的摩尔吸光系数。三、试剂1. 邻苯二甲醛试剂2. 90%醋酸3. 混合酸：等体积浓硫酸+等体积90%醋酸4. 0.1mg/ml标准胆固醇应用液5. 小牛血清四、操作步骤1、标准曲线的绘制： 取5只试管，分别加入0，0.1，0.2，0.3，0.4mL标准胆固醇应用液，再依次加入醋酸使各管体积均为0.4ml。每管加入邻苯二甲醛试剂0.2ml，蒸馏水0.01ml，加入4ml混合酸，震荡混匀，10分钟后于550nm测定吸光值，以胆固醇量mg/100ml为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。2、样品测定： 取2支试管，编号后加入醋酸0.4ml，血清0.01ml，再按照下表加入试剂。对照样品邻苯二甲
6、醛00.2无水乙醇0.20混合酸4.04.03、加毕，混匀，静置10分钟后，以对照管校0于550nm测定吸光值，从标准曲线中查出相应的浓度。五、实验结果试管编号标准胆固醇（6mg/mL）吸光度值10mL0.020.1mL0.17830.2mL0.36740.3mL0.58450.4mL0.796样品吸光度A=0.475因为K为如图所画直线斜率，所以样品中的胆固醇量为：A/K24.39(mg/100mL)由于样品中的蛋黄含量为600mg/100mL,所以蛋黄胆固醇含量为：24.39/600*100%=4.06%06级生物科学2班小组成员: 宋茜 40608064 刘芳 40608089 魏小丽 40608091 黄玮 40608095
